筋伤凝胶剂的同板多成分薄层色谱鉴别研究

马善治,潘传波,郭定彬,漆伟,刘才英▲,袁海洲,谢辉,彭文忠

(1．重庆市中医骨科医院，重庆 400012；2.成都圣洪生物科技有限公司，四川 成都 611130)

筋伤凝胶系由三七、降香、大黄、没药、乳香等药材组成的复方制剂，来源于郭剑华主任中医师临床常用“筋伤酒”，具有化瘀消肿、止痛、止血之功效，临床上主要用于跌扑损伤、血瘀疼痛、外伤出血等病症的治疗。“筋伤酒”临床使用效果较好，但酊剂在使用中有不便携带，污染衣物、疗效不够稳定等缺点，使其应用受限。为充分发挥其散瘀、消肿、促进血液循环的作用，同时为方便临床使用，课题组将酊剂变更为凝胶剂，使得药物的有效成分可以达到长期、稳定的释放。[1-2]

质量控制是保证疗效的关键环节之一，筋伤凝胶剂中君药三七依据2015年版《中国药典》用HPLC法对其活性成分人参皂苷Rg1和Rb1及三七皂苷R1的总量进行定量控制，臣药乳香、没药在2015年版《中国药典》无明确定量的活性成分，故拟用薄层色谱法定性研究。本研究在分别对大黄、乳香、没药进行薄层鉴别的基础上，进一步探索了简化鉴定方法操作步骤的可能性，最终实现了采用同一供试品溶液和展开剂，同板鉴别大黄、乳香、没药三种药味。该操作方法简便，灵敏度高。

1 材料与设备

1.1 药材和对照品

大黄对照药材(批号：120984-201202)、没药对照药材(批号：120967-201405)和乳香对照药材(批号：120970-201305)，均购于中国药品生物制品鉴定研究院。薄层层析硅胶G购于青岛海洋化工有限公司。薄层板自制，含0.25%羟甲基纤维素钠。筋伤凝胶剂为自主中试规模生产的样品(批号:20180801，20180802，20180901)。

1.2 试剂

乙酸乙酯(批号：2018120501)、乙醇(批号：2018080801)、环己烷(批号：2018061801)、乙醚(批号：2018061501)、香草醛(批号：2018072401)、硫酸(批号：2018091301)，均为分析纯，购于成都市科隆化学品有限公司。

1.3 设备

ZF-2型三用紫外分析仪(上海安亭电子仪器厂)。

2 方法与结果

本研究采用薄层色谱鉴别法，对处方中的主要药味大黄、没药、乳香进行定性鉴别。三种药味的鉴别采用同一供试品溶液，展开剂为环己烷：乙醚(4∶1)。

2.1 大黄的薄层鉴别

2.1.1 供试品溶液制备

取筋伤凝胶剂8 g，加入乙酸乙酯20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液作为薄层鉴别的供试品溶液。

2.1.2 阴性对照液制备

依照原筋伤凝胶所用各种药材处方比例，去掉大黄，同筋伤凝胶制备方法制成缺大黄的阴性凝胶，再用与筋伤凝胶中大黄药材鉴别用供试品溶液制备方法相同的方法，制成筋伤凝胶大黄薄层鉴别的阴性对照溶液。

2.1.3 对照药材溶液制备

取大黄对照药材1 g，置烧瓶中，加60%乙醇50 mL，水浴回流1 h，滤过，滤液挥至无醇味。加水30 mL，混匀，加乙酸乙酯20 mL萃取，分取乙酸乙酯液，恒温水浴80 ℃挥至约1 mL，制备成大黄对照药材溶液[3-4]。

2.1.4 结果

照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)进行试验操作，分别吸取上述筋伤凝胶供试品溶液、大黄对照药材溶液、大黄阴性对照溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷:乙醚(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365 nm下检视[5]。筋伤凝胶大黄药材薄层鉴别的供试品色谱中，在与大黄对照药材相应的位置上显示相同浅黄色的荧光斑点，而阴性对照溶液在相应位置上无斑点，如图1(a)所示。多批样品采用此相同方法检查，均获得相同稳定结果，在与大黄对照药材相应的位置上显示相同浅黄色的荧光斑点，如图1(b)所示。

图1 大黄薄层色谱图

2.2 没药的薄层鉴别

2.2.1 供试品溶液制备

没药的活性成分为挥发油，其主要化学成分为单萜、倍半萜、三萜、甾体、木脂素等[6-8]，故鉴别研究首先考虑以没药的挥发性成分为对照对其进行鉴别。对照药材用乙醇提取，水浴挥干乙醇，水溶残渣，乙醚提取提取挥发性成分；凝胶样品、阴性样品分别用乙醇超声提取，水浴挥干乙醇，水溶残渣，乙醚提取提取挥发性成分。对照药材溶液、供试品溶液、阴性样品供试液分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷:乙醚(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯365 nm下检视。专属性不强,如图2所示。因此，本研究考虑从没药的乙酸乙酯部位考察其专属性。取2.1.1项下供试品溶液作为供试品溶液。

图2 没药挥发性成分薄层色谱图

2.2.2 阴性对照溶液制备

依原处方比例，去掉没药，同筋伤凝胶制备方法制成缺没药的阴性凝胶，并使用同2.1.1项下供试品溶液相同方法，制成缺没药的阴性对照溶液。

2.2.3 对照药材溶液制备

取没药对照药材1 g，置烧瓶中，加60%乙醇50 mL，置水浴回流1 h，滤过，滤液挥至无醇味。加水30 mL，混匀，加乙酸乙酯20 mL萃取，分取乙酸乙酯液，恒温水浴80℃挥至约1 mL制备成没药药材薄层鉴别的对照药材溶液。

2.2.4 结果

照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》四部通则0502)试验操作，分别吸取上述供试品溶液、没药薄层鉴别的对照药材溶液、没药薄层鉴别的阴性对照溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷:乙醚(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯365 nm下检视。筋伤凝胶没药药材薄层鉴别的供试品色谱中，在与没药对照药材薄层色谱相应的位置上显相同淡蓝颜色的荧光斑点,而阴性对照溶液在相应位置上无斑点，如图3(a)所示。多批样品采用此相同方法，均清晰检视淡蓝色的荧光斑点，结果稳定，在与没药对照药材薄层色谱相应的位置上显相同淡蓝颜色的荧光斑点，如图3(b)所示。

图3 没药薄层色谱图

2.3 乳香的薄层鉴别

2.3.1 供试品溶液制备

乳香的活性成分为挥发油，其主要化学成分为五环三萜类化合物[9-10]。《中国药典》2015年版一部规定了乳香药材(气相色谱法)鉴别挥发性成分，故试验研究中首先尝试用药材的挥发性成分为对照，对方中乳香进行鉴别。对照药材和凝胶成品均用乙醇超声提取，将提取液分别挥至少量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷∶乙醚(4∶1)为展开剂，展开，取出晾干，喷10%硫酸乙醇，置105 ℃烘箱中加热至显色，发现对照药材和供试品色谱中斑点均不明显，专属性不强。如图4所示。因此考虑从乳香的乙酸乙酯部位考察其专属性。故取2.1.1项下供试品溶液作为供试品溶液。

图4 乳香挥发性成分薄层色谱图

2.3.2 阴性对照溶液制备

依原处方比例，去掉乳香，同筋伤凝胶制备方法制成缺乳香的阴性凝胶，并同供试品溶液相同方法制成缺乳香的阴性对照溶液。

2.3.3 对照药材溶液制备

取乳香对照药材1 g，置烧瓶中，加60%乙醇50 mL，置水浴回流1 h，滤过，滤液挥至无醇味。加水30 mL，混匀，加乙酸乙酯20 mL萃取，分取乙酸乙酯液，恒温水浴80℃挥至约1 mL制备成乳香对照药材溶液。

2.3.4 结果

照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》四部通则0502)试验,分别吸取上述供试品溶液、乳香薄层鉴别的对照药材溶液、乳香薄层鉴别的阴性对照溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷∶乙醚(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷1%香草醛硫酸溶液显色,在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。供试品色谱中，在与乳香对照药材色谱相应的位置上显相同的红色斑点，而阴性对照溶液在相应位置上无斑点，如图5(a)所示。多批样品采用此相同方法，均获得相同稳定结果，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，如图5(b)所示。

图5 乳香薄层色谱图

2.4 三味药材的同板薄层鉴别

将大黄、没药、乳香的对照药材溶液与筋伤凝胶的供试品溶液点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷 ∶乙醚(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯365 nm下检视，分别检视大黄药材(浅黄颜色的荧光斑点，比移值Rf约为0.48、0.58)和没药药材(淡蓝颜色的荧光斑点，比移值Rf约为0.33，然后再喷1%香草醛硫酸溶液显色，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视乳香红色斑点(比移值Rf约为0.52、0.68)，结果如图6所示，(a)为紫外光下检视结果，可以看见样品色谱在大黄、没药对照药材色谱各自在相应的位置上显示的相同颜色的荧光斑点，(b)为喷洒1%香草醛硫酸溶液显色后日光下的检视结果，可以看见样品色谱在乳香对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。由此可见，在实际的操作中，可以通过同一张薄层板，同一展开系统一次展开，同时完成大黄、没药、乳香三味药味的薄层色谱鉴别。

图6 大黄、没药、乳香的同板薄层色谱图

3 讨论

《中国药典》2015年版一部乳香、没药药材薄层鉴别均鉴别其各自含有挥发性成分[11]，故本研究首先对乳香、没药挥发性成分进行鉴别考察研究，结果均未找到其专属性的挥发性成分的特征斑点。分析原因：本品为凝胶剂，1 g筋伤凝胶成品载生药材1 g，乳香、没药药材含挥发性成分均为3%左右，由于提取过程的损失，加上从凝胶中提取挥发性成分的难度，未找到乳香、没药的挥发性特征斑点。所以，我们需要考虑选取乳香和没药的其他特征成分进行鉴别。根据文献[12-14]报道，乙酸乙酯部位的五环三萜类化合物是乳香中具有特征性的有效成分，包括β-乳香酸、乙酰基-β-乳香酸、α-乳香酸、乙酰基-α-乳香酸、表羽扇豆醇乙酸酯、羽扇-20(29)-烯-3α-乙酰氧基-24-酸等；乙酸乙酯部位的倍半萜成分是没药镇痛功效的有效成分，包括呋喃桉烷-1，3-二烯、莪术烯、烷吉酮等。因此，我们确定乙酸乙酯部位的活性成分作为3种药材的特征鉴定部位。

本实验通过对筋伤凝胶中大黄、没药、乳香三味中药材的探索性研究，发现有共同的薄层行为，遂大胆采用同一供试品溶液，同一展开剂对大黄、乳香、没药进行薄层鉴别研究，结果显示，本鉴别方法灵敏度高，专属性强、操作简便，色谱特征斑点清晰，阴性对照无干扰，重现性好，为中药多药味鉴别提供了新的思路。