猕猴桃溃疡病病原菌的研究进展

杜贞娜 程 斐 郭怀宇 臧 威 孙剑秋 郭天荣

(1.绍兴文理学院 生命科学学院，浙江 绍兴 312000；2.浙江塔牌绍兴酒有限公司，浙江 绍兴 312032)

猕猴桃(kiwifruit)是一种重要的经济水果作物，风味独特，维生素C含量非常丰富，被誉为“水果之王”[1-2].近年来水果市场需求旺盛，我国猕猴桃种植面积也不断扩大，但是猕猴桃溃疡病(Kiwifruit bacterial canker)的发生，已经成为影响猕猴桃产业发展主要的限制因素[3-5].

猕猴桃溃疡病的病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，简写为Psa)，可以在短时间内造成大面积猕猴桃发病死亡，具有发生范围广、传播迅速、致病性强和防治难度大等特点.该病原菌引起的猕猴桃溃疡病在1980年首次发现于日本，蔓延至今，全球的主要猕猴桃产区均有发生[6-9].国内外关于猕猴桃溃疡病病原菌Psa的研究成果，最初主要关注病原菌的致病性、形态学、生理生化特征及发病规律等.近年来，随着现代分子生物学技术的快速发展，为猕猴桃溃疡病病原菌的研究提供了新工具和新途径[10-11]，在猕猴桃溃疡病早期诊断、致病机理、菌体遗传特征等方面的研究工作取得重要进展[1,11-12].根据国内外研究成果，从病原菌的分布和危害、形态学特征、生理生化特性、分子鉴定和致病力等方面，总结猕猴桃溃疡病病原菌的最新研究进展，为深入开展猕猴桃溃疡病病原菌的相关研究提供参考.

1 猕猴桃溃疡病的世界分布及发病症状

猕猴桃溃疡病病原菌在日本首次报道后，陆续在其他国家出现.1988年，Psa出现在韩国种植的猕猴桃“Hayward”品种中，造成了韩国果农的巨大经济损失，随后在意大利第一次爆发[13-14].根据文献报道[6,15-17]，葡萄牙、西班牙、法国、土耳其、智利、新西兰、法国、伊朗等国家也发生过由Psa引起的猕猴桃溃疡病.2008年，猕猴桃溃疡病曾在全球爆发，给猕猴桃产业造成了严重损失[3,18-19].

我国境内，1985年在湖南最早发现病原菌Psa，之后在四川、安徽陆续出现[9,20]，近年来在陕西、云南、贵州、河南、福建、重庆、广州、江西、浙江等[6,9,21-22]省份的猕猴桃主产区爆发的猕猴桃溃疡病，造成猕猴桃植株出现不同程度的发病或死亡，直接影响猕猴桃产业的健康发展.1996年猕猴桃溃疡病病原菌被列入我国森林植物检疫对象名单[22]，我国和新西兰、美国、欧洲植物保护组织(EPPO)已分别将Psa作为植物检疫对象和A2类检疫性有害生物，以控制该病原菌的迅速传播和重视其严重性[23].

因为猕猴桃溃疡病病原菌Psa具有潜伏性，所以猕猴桃患病初期症状并不明显或不表现症状.秋季发病时，皮孔和芽是病原体的主要定殖点，之后病原菌以潜伏形式在受到感染的皮层组织中存活，经历冬季末到初春传播到整株树[24-25]，每年3月中旬病症明显，主要危害猕猴桃的枝干、枝条、叶片、花及幼果等部位[2,26].Psa感染宿主的伤口或自然开口后，病斑初期呈水渍状，溢出乳白色粘液，之后与树皮组织中的色素混合，形成深红色的菌脓，割开皮层可以看见韧皮部褐变溃烂，木质部呈现为红褐色；叶子上的症状呈现出黄绿色或黄色斑点，病斑边缘有不规则或多角形的黄色晕圈；嫩枝感病后其上子叶卷曲，花蕾萎蔫及不能张开等[24-27].Psa可以借助雨水、风、直接接触过的农具以及出入林园的人员实现迅速传播，如果有一株猕猴桃患病，不及时处理或处理不当会引起整个果园的植株患病，甚至是相邻的果园患病[1,27-29].Donati等发现，花柱是Psa生长和渗透到寄主组织的关键部位，昆虫也可能成为该病原菌的传播载体[3,29].

2 猕猴桃溃疡病的病原菌鉴定

2.1 形态学特征与生理生化特性

猕猴桃溃疡病受到国内外植物保护学者的广泛关注，对病原菌Psa的特征和特性已经比较了解[25-27,30-31].在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，病原菌Psa菌落为乳白色或奶油色、圆形半凸起、半透明黏稠状，边缘整齐、表面光滑，生长缓慢；革兰氏染色阴性，好氧、杆状，无荚膜和芽胞，极性鞭毛，少数为2～3根鞭毛；病原菌Psa的生理生化特性参见表1.

表1 病原菌Psa的培养特征和生理生化特性

2.2 分子生物学鉴定

随着分子生物学技术的发展和进步，基于分子生物学技术的植物病原菌快速检测方法逐步建立，被广泛应用于水稻白叶枯菌病(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)[32]、欧榛溃疡病和腐烂病(P.syringaepv.theae)[33]、马铃薯晚疫病(Phytophthorainfestans)和环腐病(Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicum)[34]等植物病害研究.早期对猕猴桃溃疡病病原的研究主要是通过发病症状、病原菌的形态以及生理生化特性等传统的方法进行，费时费力、稳定性差，研究结果还可能受到人为主观因素干扰[7,20].猕猴桃溃疡病的分子检测方法，具有检测快、准确性和灵敏度高、特异性好等优点，表现出明显的技术优势.

Koh和Nou[35]通过对Psa基因组的分析，设计了一对特异引物，从Psa基因组中扩增到一条为492 bp的条带(KN-PCR)，能在感染病害而没有表现任何症状的猕猴桃中检测出致病菌.Lee等[36]利用RAPD技术对日本和韩国的Psa菌株进行了比较，发现日本和韩国的Psa菌株具有不同的系统发育起源.Rees-George等[37]根据rDNA的ITS序列，基于PCR技术设计特异性引物PsaF1/F2和PsaF3/F4，从Psa基因组扩增出两条特异性条带(RG-PCR)，该技术能够用于鉴定、快速筛选病原菌以及准确检测到寄主组织的带菌情况.Gallelli等[26]基于avrD1基因的序列结构重新设计了duplex-PCR检测方法，该方法可以有效地区分P.syringaepv.actinidiae菌株和P.syringaepv.theae菌株及其他遗传相近的P.syringae菌株，被成功应用于直接检测感染的猕猴桃基质中存在的Psa.根据EvaGreen化学原理，结合定性PCR(PCR-C)技术，建立了实时定量荧光PCR检测方法，这两种方法都是基于Psa的hrpW基因片段的特异引物组，而且都具有很高的特异性，分别可以检测到50 fg和200 fg，并被应用于有症状和无症状猕猴桃器官或组织的病原监测[38].

我国的植物保护学者在猕猴桃溃疡病病原菌的分子检测方面也开展了系列研究工作.刘瑶[39]设计了特异引物F7/R7，可以成功地将不稳定的RAPD标记转化为SCAR标记，检测到接种病原菌的猕猴桃枝条中致病菌和自然感病状态下枝条中病原菌，但是该特异引物可以快速检测四川分离出的Psa菌株，而不能用于快速检测陕西分离的Psa菌株.周大祥等[40]利用EMA-qPCR建立了快速检测猕猴桃溃疡病的活菌检测技术，并且能够有效避免可能出现的假阳性结果，即EMA-qPCR比qPCR更能克服假阳性结果的出现，可以准确反映实际样品的带菌情况，检测时间更短.He等[9]采用rep-PCR、IS50-PCR和RAPD-PCR方法对中国五个省八个采样点分离鉴定出的269个Psa菌株进行研究，发现我国的Psa具有丰富的多样性，而且菌株间的遗传变异与地理来源相关.

在PCR技术基础上建立的猕猴桃溃疡病病原菌的分子检测方法，在实际工作中被广泛运用.但是必须注意到，在检测灵敏度提高的同时，检测结果不可避免地会出现假阳性，所以需要多种分子检测方法相结合，才能确保猕猴桃溃疡病致病菌检测结果的准确性.

3 猕猴桃溃疡病的病原菌致病力

近年来，通过指纹图谱(Rep-PCR)、多位点序列分析(MLSA)和单核苷酸多态性分析(SNPs)及全基因组分析等对Psa菌株的致病力进行了深入研究[25,28]，结果发现Psa株系可以分为5种生物型(biovar 1、2、3、5、6)，简称为Psa1、Psa2、Psa3、Psa5、Psa6[41-44].Psa1最早在日本(1984)和意大利(1992)发现，能合成菜豆毒素(phaseolotoxin)；Psa2仅发生在韩国(1988)，具有冠状碱素(coronatine)基因簇，而缺少菜豆毒素基因簇；Psa3是全球范围内最流行的猕猴桃溃疡病病原菌，主要特征是缺乏表达菜豆毒素和冠状碱素的基因，拥有4个编码效应蛋白的hop基因，对引起世界各地猕猴桃流行的Psa3菌株进行基因组分析后发现，所有Psa3菌株都源自中国的同一谱系[9,14,20].Psa5和Psa6是仅发生在日本(2012年和2015年)的类群，Psa5既不产生菜豆毒素也不产生冠状碱素，而Psa6与此相反，既可以产生菜豆毒素也可以产生冠状碱素[28,42-45].

在2010年，猕猴桃溃疡病首次发生于新西兰，Vanneste等对病原菌进行了研究分析并将其称为Psa4，与Psa1、Psa2和Psa3区分开[46].Psa4菌株与其他Psa菌株有很大不同，仅能引起猕猴桃叶片坏死病斑，不能引起枝干溃疡症状，因此重命名为P.syringaepv.actinidifoliorum[25,45,47].

4 问题与展望

由于猕猴桃溃疡病具有大规模传播、高毁灭性、较强致病性等特点，该病发生后防治难度极大，给猕猴桃产业带来巨大损失.近年来，消费市场对猕猴桃的需求增加，猕猴桃种植面积也在不断扩大，然而猕猴桃溃疡病的感染范围也随着苗木的远距离运输传播而蔓延，目前已在世界范围内的猕猴桃主产区造成了严重危害，影响猕猴桃产业的进一步发展.虽然国内外对猕猴桃溃疡病病原菌开展大量研究工作，并取得一定的研究成果，但是包括田间病原菌快速检测、病原菌与宿主的互作机制、生物防治、抗病品种选育、产区规范化管理等许多问题仍然亟待解决，高效的猕猴桃溃疡病综合防治技术亟待建立与完善.