罗尔斯通菌去除土壤重金属铅的效能及机制

黄家庆，叶菁，李艳春，刘岑薇，王义祥*

(1.福建省农业科学院 农业生态研究所，2.福建省红壤山地农业生态过程重点实验室，福州 350013)

0 引言

微生物种类多、抵抗力强和代谢迅速，对土壤的重金属修复有独特的优势，可以通过表面吸附、转化沉淀、加速氧化-还原和代谢吸收等方式降低土壤中重金属的含量和毒性[1], 还有可能改变土壤重金属形态分布，将高毒价的重金属转化为低毒价重金属化合物[2]，降解土壤有毒物质。向土壤添加微生物菌剂，可改善土壤理化性质和减少农作物吸收土壤的重金属[3]。通过人工分离和筛选得到的微生物制备成生物制剂，在治理土壤重金属方面具有操作简单、使用快捷和易推广等优势[4]，具备良好的经济效益和应用前景。获取对重金属有高耐性和强吸附力的土壤微生物，并阐明其耐性和吸附重金属的机理是开展微生物制备土壤菌剂和治理重金属污染的基本前提[5]。农业土壤重金属污染已经成为人们普遍关注的问题[6]。土壤中重金属含量升高会对微生物和农作物生长产生毒性，如细菌活性降低和农作物生长缓慢[7]，严重影响土壤微生物群落组成、土壤肥力和农作物收成[8]。

Ralstoniasp.在生物修复领域发挥着巨大的作用，尤其是在有毒有机化合物的生物降解和吸附重金属方面[9]。从重金属污染土壤中分离得到的Ralstoniasp.可以在铜、锌、铁等重金属浓度较高的营养极贫环境中生存，是重金属污染土壤生物修复的理想材料[10]。此外，Ralstoniasp.还具有重金属运输/解毒蛋白功能，可耐受多种有毒重金属(如：镉、锰、镍和铅)，对有毒重金属铅有较高的吸附能力，在控制有毒重金属铅污染方面具有潜在的应用前景。RalstoniaBcul-1对重金属离子有较强的耐受浓度吸附效率[11]。根据《土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准(试行)GB15618-2018》，农用地土壤污染风险筛选值，在酸性的土壤(pH<7)重金属铅的风险筛选值为70～120 mg·kg-1。福建省各地的土壤存在重金属铅污染(一共检测25个地区)，铅含量较低的地区有18个，其土壤铅的含量为18.60～61.90 mg·kg-1，存在铅污染的地区有7个，其土壤铅的含量为72.80～278 mg·kg-1，但重金属铅含量高于100 mg·kg-1仅有3个地区，铅含量分别为127、221 和278 mg·kg-1[12]。福建省部分酸性农用土壤重金属含量较高，需要进行重金属铅的修复治理。

分离RalstoniaBcul-1的酸性土壤(pH 5.62)重金属镉、锌、铜和铅含量分别为0.42、296.68、179.95 和87.35 mg·kg-1[11]，土壤重金属镉和铅含量超过了农业用地土壤污染风险筛选值。实验获得源于矿区附近的菜园酸性土壤，重金属铅含量为94.37 mg·kg-1，也超过农业用地土壤污染风险筛选值。这些实验材料为研究RalstoniaBcul-1吸附和去除土壤重金属铅的机制提供了非常便利的条件。开展RalstoniaBcul-1在铅污染的土壤中生存状况和对重金属铅的去除效能，有利于应用RalstoniaBcul-1修复重金属铅污染的土壤。

1 材料与方法

1.1 供试材料和细菌在土壤的生长

罗尔斯通菌(RalstoniaBcul-1)由福建省农业科学学院农业生态研究所自行分离得到。纯化、培养和收集RalstoniaBcul-1菌体请参考黄家庆等[11]的实验方法。

收集福建省矿区附近重金属铅污染的酸性菜园土壤。菜园土壤和RalstoniaBcul-1菌的混合物在恒温摇床上(25℃, 150 rpm，光照8 h，黑夜16 h)培养2、4、6、8和12 d。按照设定的RalstoniaBcul-1生长时间点取出土壤，加入ddH2O(土壤:ddH2O=1∶1)搅拌均匀后，静止1～2 min，分离出土壤悬浮物(包括泥浆)和土壤沉淀物，分别测定土壤悬浮物和土壤沉淀物的重金属铅含量。

1.2 菜园土壤总铅含量和土壤悬浮物铅含量的测定

土壤总铅含量和土壤沉淀物的测定：(1)称取2 g样品，放入大玻璃试管中。(2)加入200 μL浓硫酸(H2SO4)和20 mL氢氟酸(HF)，将温度升高至200℃，直至溶液被蒸发至干燥。(3)加入15 mL浓硝酸(HNO3)，4 mL 浓硫酸，10 mL高氯酸(HClO4)，继续加热至产生白烟。(4)等到溶液冷却至室温后，用ddH2O多次洗涤容器，最后用ddH2O将体积定容为100 mL(此时做一个空白对照实验)。用火焰原子吸收光谱仪(PERSEE，TAS-990，中国)测定溶液中重金属铅的含量。

土壤悬浮物(包括泥浆)重金属铅含量的测定：(1)将已经培养2、4、6、8和12 d的土壤和RalstoniaBcul-1混合物从摇床取出，搅拌均匀后，将土壤悬浮物(包括泥浆)转移到50 mL离心管。(2)土壤悬浮物加入混合酸(HNO3: 65%, HClO4: 70%, HF: 40%)后，在微波消解系统(Matthews, CEM MARS-5, NC，美国)进行消化。(3)参考“土壤总铅含量和土壤沉淀物的测定”的简明步骤(1)～(4)测定土壤悬浮物中重金属铅的含量。

1.3 测定Ralstonia Bcul-1菌的生长曲线

将含不同Pb2+(PbC4H6O4.3H2O，培养基pH<6.50，避免Pb2+水解而产生沉淀)浓度的新鲜LB培养基接种细菌(新鲜菌液∶LB培养基=1∶100)，在30℃摇床上培养0～48 h。按照设定的时间间隔，在特定的时间点取出部分菌液，用分光光度计测定OD600nm处菌液的吸光度来计算菌液浓度(TU-1901双光束紫外可见分光光度计, 北京普析通用仪器有限责任公司)，以此确定RalstoniaBcul-1菌的生长曲线。

1.4 Ralstonia Bcul-1对培养液中重金属铅的去除效率

在含Pb2+的培养液中加入新鲜RalstoniaBcull-1菌液(新鲜菌液∶培养液=1∶100)，在摇床中振荡过夜培养(30℃，200 rpm，>16 h)。高速离心(25℃，10 000 rpm, 15 min)去除培养液中的菌体，保留上清液。用火焰原子吸收光谱仪(PERSEE，TAS-990，中国)测定上清液中Pb2+含量。所有实验均独立进行，每个实验至少重复3次，数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示。各个处理均以不加菌的培养液作为对照计算RalstoniaBcul-1菌体对培养液中Pb2+的去除效率。

表 1 用于鉴定重金属抗性基因相对表达水平的引物

1.5 细菌总RNA分离和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析

往酸性LB培养基(pH<6.50)中加入不同浓度的Pb2+和新鲜菌液(菌液:培养基=1∶100)，过夜培养后离心收集菌体，并及时提取菌体总RNA。采用TRIzolTMReagent(Invitrogen, Code No.:15596026, USA)从细菌中提取总RNA，使用HiScript®1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme Biotech, Co., Ltd#R111-01, 中国)合成cDNA。

用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(Takara, Code No.: RR037A, Japan)在Applied Biosystems QuantStudio®3 Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific, ABI QuantStudio 3, USA)进行Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)相关操作。qRT-PCR反应程序采用三步法：预变性95℃ 3 min；95℃ 10 s, 55℃ 30 s, 65℃ 15 s; 40 cycles。16S rRNA基因作为qRT-PCR实验的内参基因(表1)。

1.6 细菌总蛋白质提取和蛋白SDS-PAGE电泳

在室温下，从含不同浓度Pb2+的LB液体培养基中，通过低温离心(8 000 rpm, 10 min, 4℃)收集细菌菌体。12%丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)电泳对细菌总蛋白进行分离和染色请参考黄家庆等[11]提供的实验方法。

1.7 细菌数据处理和图表绘制

图 1 Pb2+胁迫下Ralstonia Bcul-1(OD600nm)的生长曲线

采用IBM SPSS 23统计软件(Version 23, USA)或R软件(Version 4.0.2, USA)进行数据统计分析。铅含量差异分析采用单因素方差分析(One-way analysis of variance)，分析方法为Duncan’s test，P< 0.05(*)或者0.01(**)为显著性水平。

2 结果分析

2.1 Pb2+胁迫下Ralstonia Bcul-1持续稳定生长

在5 mg·L-1和10 mg·L-1Pb2+胁迫下，实验组的RalstoniaBcul-1菌液浓度在30 h时达到最大值(5 mg·L-1OD600nm=1.45，10 mg·L-1OD600nm=1.20)(图1)。但对照组的RalstoniaBcul-1菌液浓度在24 h时就已经达到最大值(0 mg·L-1OD600nm=1.75)。在Pb2+胁迫下，RalstoniaBcul-1在生长初期出现明显的滞后期，在生长30 h后菌液浓度均呈现持续下降的趋势，说明Pb2+对RalstoniaBcul-1的生长具有抑制作用。但2个实验组(5 mg·L-1和10 mg·L-1Pb2+)的细菌生长曲线总体形状与对照组(0 mg·L-1Pb2+)生长曲线相似，而且2个实验组与对照组的菌液浓度差异并不显著(0 mg·L-1OD600nm= 0.13～1.75；5 mg·L-1OD600nm= 0.11～1.45；10 mg·L-1OD600nm= 0.11～1.20)。5 mg·L-1和10 mg·L-1Pb2+对RalstoniaBcul-1生长并无显著的抑制作用。RalstoniaBcul-1在含Pb2+的培养基持续生长48 h后，菌液浓度仍保持较高的水平(0 mg·L-1OD600nm= 1.30；5 mg·L-1OD600nm= 1.12；10 mg·L-1OD600nm= 1.01)，并且2个实验组与对照组的菌液浓度差异进一步减少。RalstoniaBcul-1菌株可以抵抗有毒Pb2+的胁迫，具备在重金属铅污染的土壤中生长的能力。

图 2 Ralstonia Bcul-1 对LB培养基中Pb2+的去除效率

2.2 Ralstonia Bcul-1对Pb2+有较强的吸附能力

在液体LB培养基加入浓度为2.5、5、10和15 mg·L-1的Pb2+(PbC4H6O4.3H2O)，按1∶100加入新鲜RalstoniaBcul-1菌液，过夜培养后测试RalstoniaBcul-1菌体对Pb2+的吸附能力。当LB培养基中Pb2+浓度为2.5、5、10和15 mg·L-1时，RalstoniaBcul-1菌体对Pb2+的去除率分别为15.88%、22.14%、29.09%和8.22%(图2)。除了15 mg·L-1Pb2+，RalstoniaBcul-1菌体对2.5、5和10 mg·L-1Pb2+均保持较高的去除效率，说明RalstoniaBcul-1可以吸附有毒的Pb2+，具有吸附土壤重金属铅的能力，需要对RalstoniaBcul-1吸附Pb2+的机理作进一步研究。

2.3 Ralstonia Bcul-1重金属抗性基因响应Pb2+的胁迫

通过测定部分重金属抗性基因的表达水平检测RalstoniaBcul-1对Pb2+胁迫的响应，以0 mg·L-1Pb2+的重金属抗性基因表达水平作为参照(图3)。czcA受2.5 mg·L-1和5 mg·L-1Pb2+诱导，表达量上调至1.28和1.37倍，但受10 mg·L-1和15 mg·L-1Pb2+抑制，表达量下调至0.79和0.43。czcB显著受2.5、5和10 mg·L-1Pb2+诱导，表达量上调至1.15、1.84和2.51倍，但受15 mg·L-1Pb2+抑制，表达量下调至0.58。ftsZ受2.5 mg·L-1和5 mg·L-1Pb2+轻微诱导，表达量上调1.15和1.08倍，但受10 mg·L-1和15 mg·L-1Pb2+抑制，表达量下调至0.85和0.41。mutS持续受2.5、5、10和15 mg·L-1Pb2+抑制，表达量下调至0.65、0.62、0.58和0.45，2.5～15 mg·L-1Pb2+均能抑制mutS的表达。低浓度Pb2+可以诱导czcA，czcB和ftsZ的表达，表达量上调至1.15～2.51倍，这些重金属抗性基因的转录表达水平明显增强；高浓度Pb2+虽然抑制czcA，czcB和ftsZ的表达，但表达量仅下调至0.41～0.58倍，这些重金属抗性基因仍然维持较高的表达水平。RalstoniaBcul-1部分重金属抗性基因响应Pb2+胁迫，对Pb2+具有较强的抵抗能力，使其可以生长在含重金属铅的环境。

图 3 不同Pb2+浓度胁迫下重金属抗性基因的相对表达量

图 4 Pb2+胁迫下Ralstonia Bcul-1的总蛋白谱

2.4 Ralstonia Bcul-1蛋白表达受Pb2+的抑制

采用SDS-PAGE凝胶电泳法分析RalstoniaBcul-1受Pb2+胁迫引起的蛋白质表达图谱变化。2.5、5、10和15 mg·L-1Pb2+均可使RalstoniaBcul-1的蛋白质表达发生变化(图4)。蛋白条带的变化主要发生在分子质量35～130 kDa的区域，一共有5条蛋白条带被抑制表达(黑色三角形所示)，其表达量明显减弱，甚至消失。RalstoniaBcul-1有些蛋白响应Pb2+胁迫而改变其表达量，这些蛋白可能参与了对Pb2+的抵抗和吸附，从而增强RalstoniaBcul-1在重金属铅污染土壤的生存能力。此外，在2.5、5、10和15 mg·L-1Pb2+胁迫下，RalstoniaBcul-1的蛋白表达图谱与对照组(0 mg·L-1Pb2+)保持相似的蛋白条带，其蛋白表达具有较强的稳定性。

2.5 Ralstonia Bcul-1减少土壤悬浮物(包括泥浆)中重金属铅的含量

酸性菜园土壤(pH 5.32)的重金属铅总含量为94.37 mg·kg-1，土壤悬浮物(包括泥浆)的重金属铅含量为32.67 mg·kg-1，土壤沉淀物的重金属铅含量为61.70 mg·kg-1。根据“土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)GB15618-2018”，农业酸性土壤中重金属铅的风险筛查阈值为100 mg·kg-1(土壤pH≤6.50)。本研究采用的酸性土壤铅总含量为94.37 mg·kg-1，仍然属于风险较高的重金属铅污染土壤。试验结果表明，在共培养的条件下，RalstoniaBcul-1可在重金属铅污染的酸性菜园土壤中持续生长12 d。以未添加RalstoniaBcul-1菌体的土壤悬浮物总铅含量作为对照，添加RalstoniaBcul-1菌体处理的土壤悬浮物总铅含量出现了显著的下降(**:P<0.01)(图5)。在RalstoniaBcul-1生长的第2、4、6、8和12 d，土壤悬浮物重金属铅的含量下降到了27.26、28.39、24.62、23.02和27.99 mg·kg-1，RalstoniaBcul-1菌体对土壤悬浮物重金属铅的去除效率分别达到12.71%，13.83%，22.74%，24.71%和14.01%(图6)。其中，在RalstoniaBcul-1生长的6 d和8 d，RalstoniaBcul-1菌体对酸性菜园土壤悬浮物重金属铅的吸附效率达到最大值。在没有额外添加营养物质的情况下，RalstoniaBcul-1菌株能在重金属铅污染的土壤持续生长12 d，并且菌体对重金属铅保持较高的吸附能力，具备治理菜园酸性土壤重金属铅污染的潜力。

注：CPb：土壤沉淀物总铅含量，RCPb：添加Ralstonia Bcul-1菌体处理的土壤沉淀物总铅含量，TPb：土壤悬浮物总铅含量，RTPb：添加Ralstonia Bcul-1菌体处理的土壤悬浮物总铅含量。

图 6 Ralstonia Bcul-1对蔬菜土壤铅的吸附效率

3 讨论和结论

重金属铅对土壤生长的小麦和大白菜具有很强的毒性，不但影响农作物的生长和产量，还影响人们摄入蔬菜的安全性[13]。此外，重金属铅对土壤微生物也有毒性。治理土壤重金属铅污染具有重要的意义[14]，尤其对于日益酸化的耕地土壤[15]，选取经济有效的治理方法一直是研究的重点方向。

研究发现，RalstoniaBcul-1具有重金属的广谱抗性，对有毒的重金属(镉和铬)有很高的耐受浓度和去除效率，更为重要的是，RalstoniaBcul-1可在营养成分匮乏的菜园土壤持续生长，是治理重金属污染的优良菌株[11]。细菌重金属抗性基因在土壤细菌耐受重金属时发挥着非常重要的作用。CzcCBA(czcA和czcB)、FtsZ和MutS重金属抗性基因表达水平的上升和维持高水平的表达可以增加细菌对重金属的耐受能力，使土壤细菌可以在重金属含量较高的土壤中存活[16]。罗尔斯通菌(RalstoniaBcul-1)在低浓度Pb2+(<10 mg·L-1)胁迫下，czcA，czcB和ftsZ基因表达水平上升，即使在15 mg·L-1Pb2+浓度，czcA，czcB，ftsZ和mutS表达水平仍然维持在0.65、0.62、0.58和0.45，使得RalstoniaBcul-1可以在重金属铅含量为94.37 mg·kg-1的酸性土壤中存活，并吸附土壤的重金属铅。与PseudomonasputidaKT2440[17]、Pseudomonaskoreensis、Pantoeasp.、Escherichiacoli、Ralstoniametallidurans和Chryseobacterium sp.[18]类似，重金属离子(Cd2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Cr3+、Co2+和Mn2+)胁迫可增加RalstoniaBcul-1重金属抗性基因的表达水平[11]。但通过维持czcA、czcB、ftsZ和mutS基因较高的表达水平，可以使RalstoniaBcul-1存活在重金属污染(镉 0.42 mg·kg-1，锌 296.68 mg·kg-1，铜 179.95 mg·kg-1和铅 87.35 mg·kg-1)的矿区周围土壤，同时可以生长在重金属铅含量为94.37 mg·kg-1酸性菜园土壤，并且对土壤悬浮物重金属铅的去除效率达到24.71%。RalstoniaBcul-1的重金属抗性基因和抗性蛋白响应Pb2+的胁迫，增强了RalstoniaBcul-1耐受重金属铅的能力，使其可存活在被高含量重金属铅污染的土壤。

此前的实验结果显示，RalstoniaBcul-1菌体对重金属离子Cd2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Cr3+和Mn2+有很高的耐受能力和吸附效率，对有毒的重金属离Sb3+，Ag+和Hg2+也具备一定的耐受能力[11]。此次研究结果得到，RalstoniaBcul-1对酸性土壤重金属铅有较高的耐受能力和去除效率。RalstoniaBcul-1从矿区附近被多种重金属污染的土壤分离出来，其可以在重金属污染的土壤中生存，尤其是被重金属镉和铅污染的菜园土壤。耐受多种高浓度重金属离子的胁迫，使得RalstoniaBcul-1可以在被重金属铅污染的酸性土壤生长。在重金属铅总含量达到94.37 mg·kg-1的酸性菜园土壤，在不添加营养物质的情况下，RalstoniaBcul-1可持续生长12 d，并且在生长的第6 d和第8 d，其对土壤悬浮物(重金属铅含量为32.67 mg·kg-1)重金属铅的去除效率高达22.74%和24.71%。在一定生长时间内(6～8 d)，RalstoniaBcul-1对土壤重金属铅保持较高的吸附能力。福建省各地大部分土壤重金属铅含量18.60～96.80 mg·kg-1[12]，RalstoniaBcul-1对酸性土壤的重金属铅有较强的耐受能力和较高的吸附效率，可制备成治理土壤重金属污染的优秀菌剂，应用于修复有毒重金属铅污染的酸性菜园土壤。