佩利措伊斯-梅茨巴赫病临床及遗传学特征分析

牛国辉，张晓莉，李林琛，刘红星，崔 博，王 鑫，谢加阳，贾天明

(1.郑州大学第三附属医院儿童康复科，河南 郑州 450052；2.郑州大学第三附属医院小儿神经内科，河南 郑州 450052)

佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbache disease，PMD)是最常见的弥漫性脑白质髓鞘形成障碍性疾病，遗传方式为X连锁隐性遗传，由编码蛋白脂蛋白1(proteolipid protein l，PLP1)基因变异所致[1-2]；PMD临床上主要表现为眼球震颤、听力障碍、肌张力低下、共济失调及进行性运动功能障碍[3]。PMD的临床表现缺乏特异性，且大部分患者存在肌张力异常，很容易造成误诊。本研究旨在通过对2015年6月至2020年10月郑州大学第三附属医院临床及基因诊治的14例PMD患儿的临床、影像学资料及基因检测结果进行回顾性分析，探讨PMD的临床及分子遗传学特征，以期为进一步的遗传咨询、产前诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2015年6月至2020年10月在郑州大学第三附属医院儿科及康复科就诊的12个家系共14例PMD患儿为研究对象。纳入标准：(1)存在眼球震颤、发育迟缓、肌张力减退、共济失调、锥体外系体征、痉挛性截瘫等典型临床表现；(2)头颅磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)提示脑白质髓鞘化障碍；(3)PLP1基因检测异常；(4)患儿监护人知情同意并签署知情同意书。排除标准：(1)临床或基因检测资料不全；(2)其他原因所致弥漫性脑白质髓鞘形成障碍性疾病。14例PMD患儿中，10例为散发病例(病例1～10)，病例11和12系兄弟两人，病例13和14系兄弟两人。父母均非近亲婚配，身体健康，围生期均未见异常。患儿各项生物化学检查及血尿代谢筛查均未见异常。本研究经医院医学伦理委员会批准[(2017)医伦审第10号]。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集收集先证者及家系受累成员的临床表现、辅助检查结果[包括头颅MRI、发育评估情况、脑干听觉诱发电位(auditory brainstem response，ABR)]等，0～6岁患儿发育评估采用Gesell发育量表[4]中的适应能力及大运动能区的发育商(development quotient，DQ)评估，>6岁患儿采用韦氏儿童智力量表[5]的总智商评估。

1.2.2 基因突变检测采集14例患儿的外周静脉血3 mL，乙二胺四乙酸抗凝，利用磁珠法自动核酸提取仪提取血液样本中基因组DNA，应用分光光度计测量DNA的浓度及纯度。因PLPl基因变异以重复突变为主，首先应用多重连接探针扩增(multiple ligation probe amplification，MLPA)方法对患儿进行PLPl基因变异检测，使用MRC-Holland MLPA试剂盒进行多重探针连接探针，采用基因分析仪ABI3730xL进行片段分析检测，试剂盒购自荷兰MRC Holland生物公司，严格按照试剂盒说明进行操作。若MLPA检测未发现异常，进一步通过靶向捕获二代测序法进行基因检测；根据靶向捕获测序结果，对患儿及其父母DNA进行Sanger测序验证。

2 结果

2.1 PMD患儿的临床特征分析结果结果见图1和表1。14例患儿均为男性，就诊年龄5 d至10岁，起病年龄1 d至7个月。首发症状：眼球震颤9例(64.2%)，大运动发育迟缓3例(21.4%)，呻吟样呼吸、哭声弱1例(7.1%)，异常姿势2例(14.3%)。临床表现：14例患儿存在发育迟缓，其中10例以运动发育迟缓更为明显，3例(病例7、10、13)运动、智力发育迟缓程度接近。8例>1岁的患儿中1例能够独立行走，其余7例无独立行走能力；12例存在眼球震颤，2例无眼球震颤。肌张力低下10例，肌张力增高3例，肌张力正常1例。临床分型：经典型8例，先天型2例，中间型4例。头颅MRI：14例患儿头颅MRI均表现为T2加权像弥漫性高信号，提示脑白质髓鞘化障碍(图1)。病例9因为四肢肌张力低下，膝腱反射未引出，行肌电图检查，提示四肢神经源性损害，其余病例未做肌电图检查。14例患儿均行ABR检测，其中7例异常。

A：第三脑室上部层面；B：侧脑室体部层面；箭头示脑白质高信号。

表1 14例PMD患儿的临床特征

2.2 14例PMD患儿PLP1基因突变检测结果结果见表2。12例先证者中，通过MLPA检测发现7例(病例1、2、3、4、5、6、7)为2～8号外显子重复变异。全外显子检测发现1例(病例8)为X染色体Xq22.2处重复0.33 Mb区域，覆盖了 PMD 100.00%的区域；1例(病例9)为c.83G>A变异，1例(病例10)为c.226G>C变异，2例(病例11、12)为c.259delC变异，2例(病例13、14)为c.157dupA变异。家系验证分析显示，12例先证者的基因变异均来自无临床表型的母亲。

表2 14例PMD患儿PLP1基因突变的基因型特点

3 讨论

PMD为最常见的髓鞘化障碍所导致的脑白质疾病，其发病率为(1.45～1.90)/10万活产男婴，但也有女性发病的报道，推测可能的机制是由于X染色体的非随机失活[6]。PMD是单基因遗传病，近年来进行了动物模型研究及相关治疗的研究[7-8]。应用神经干细胞和神经胶质祖细胞移植进行治疗可取得一定疗效[9-10]；铁螯合物可降低PMD少突胶质细胞的死亡率[11]；生酮饮食可恢复少突胶质细胞的完整性并增加中枢神经系统髓鞘形成[12-13]。但上述治疗方法均未得到循证医学的支持。还有一些化学方法筛选的增强子和抑制基因表达的治疗尚处于动物实验阶段[14-16]，炎症与PMD病理生理学的关系到目前为止仍没有定论[17]。故对PMD来说目前尚无有效的病因治疗方法，主要采取针对受累功能的康复治疗，以延缓各种功能的倒退，提高生活质量[18]。因此，尽早筛查出携带者，进行产前诊断尤为重要。

PMD按起病年龄及病情的严重程度分为3型：先天型、中间型和经典型，其中经典型最为多见。先天型PMD患儿病情最为严重，出生时或生后数周内即出现症状，表现为钟摆样眼球震颤、喉鸣、吞咽困难、肌张力低下等，多于婴儿或儿童期死亡，少数存活至30岁以后。经典型PMD患儿常于出生后数月发现眼球震颤、肌张力低下及运动发育迟缓，随病程进展逐渐出现肢体痉挛，可存活至30～70岁。中间型PMD临床表现介于先天型与经典型之间[2]。在本研究中8例患儿(病例1～8)表现为经典型；2例(病例9、10)表现为先天型，2个家系兄弟共4人(病例11、12和病例13、14)表现为中间型。首发症状以眼球震颤最为常见(64.2%)，其次为大运动发育迟缓(21.4%)。在整个病程中发育迟缓(100%)、肌张力异常(92.9%)、眼球震颤(85.7%)是最常见的症状，与相关报道一致[19]。本研究还发现，先天型PMD患儿的智力和运动能力均明显落后，二者落后的程度相近，而经典型和中间型PMD患儿的运动能力落后更为明显。病例9的四肢肌电图呈神经源性损害，说明点突变致先天型PMD患儿可导致外周神经损伤PMD。14例PMD患儿中ABR异常者7例，说明听觉传导通路也容易受到损伤。而ABR异常者均为就诊时年龄较小的患儿(<1岁)，推测听通路早期的损伤随着年龄的增长有逐渐恢复的可能。头颅MRI对PMD的诊断意义重大，其表现为髓鞘形成明显落后于同龄儿，且并无脑白质破坏[20]。本研究中14例患儿均提示脑白质髓鞘化过程障碍，符合PMD的特征性头颅MRI表现。因此，在临床工作中对早期出现眼球震颤、运动发育落后且无明显高危因素的患儿应考虑到本病可能，应进一步检查头颅MRI以了解脑白质的发育情况。

PLP1为PMD的致病基因，在哺乳动物中高度保守，长约17 kb，定位于Xq22.1，含有7个外显子和6个内含子，编码PLP1蛋白和DM20蛋白，PLP1蛋白由276个氨基酸组成，DM20是其剪切异构体，比其短35个氨基酸。PLP1蛋白主要在中枢神经系统少突胶质细胞产生的髓鞘中表达，是髓鞘的主要成分。PLP1基因存在多种变异类型，目前已发现与PMD 相关的 PLP1基因突变约有335种，包括重复变异、点突变、缺失变异，近年来发现内含子缺失也可致病[21]，其中最为常见的是重复变异[22]，重复变异占PLP1基因突变的50%～70%。本研究首先采用MLPA方法对PLP1基因进行变异检测，未发现异常后再进行二代测序，并通过一代测序法进行位点验证及家系验证；结果发现，7例为2～8号外显子重复变异，1例为X染色体Xq22.2处重复0.33 Mb区域(覆盖了 PMD 100.00%的区域)，1例为c.83G>A变异，1例为c.226G>C变异，2例为c.259delC变异，2例为c.157dupA变异；提示PMD以重复变异[8例(占57%)]为主，与其他研究结果接近[19]。c.83G>A为错义变异，导致氨基酸由甘氨酸变为丙氨酸，对其进行保守性预测结果显示，该位点进化上保守，具有潜在的功能影响；对其进行蛋白功能预测结果显示为有害。该变异未见相关文献报道及收录，但有报道该位点的其他形式变异(c.83G>T:p.G28V)与PMD相关[23]。c.226G>C变异可导致第226位的缬氨酸被亮氨酸取代，对基因或基因产物功能可造成有害影响，已有文献报道[24]。c.259delC变异导致从第87号氨基酸Leu开始的氨基酸合成发生改变，并在改变后的第27个氨基酸终止(p.Leu87TrpfsTer27)，为移码变异，可导致蛋白质功能受到影响，为有可能致病的基因变异。c.157dupA变异导致从第54号氨基酸Asn开始的氨基酸合成发生改变，在改变后的第6个氨基酸终止(p.Asn54Lysfs*6)，为移码变异，可导致蛋白截短；在人类外显子数据库、参考人群千人基因组和人群基因组突变频率数据库中未发现该变异；最终判读为可能致病。与重复变异相比，缺失变异非常罕见，且其突变原因尚不清楚，涉及多个邻近基因的较大缺失会导致胚胎死亡，部分小的缺失患儿才能存活。PMD的临床表型与基因型存在一定的相关性。许多患者的临床表现介于先天型和经典型之间或经典型和痉挛性截瘫之间。PLP1基因重复变异多表现为经典型或中间型；点突变患者可表现为从先天型到痉挛性截瘫的所有PMD的疾病类型，但先天型PMD患儿全部是由点突变所致；缺失变异患儿一般临床症状较轻，可仅表现为痉挛型截瘫或无PLP1综合征[2]。在本研究中重复突变患者(病例1～8)均表现为经典型；而6例点突变患者中有2例表现为先天型(病例9、10)，推测突变位点位于PLP1基因的保守区域，而2个家系兄弟共4人(病例11、12和病例13、14)表现为中间型，突变位点可能位于PLP1基因的非保守区域。

综上所述，本研究显示PMD患儿的首发症状以眼球震颤最为常见；发育迟缓、肌张力异常、眼球震颤是最常见的临床症状；头颅MRI提示脑白质髓鞘化障碍。PLP1基因突变中重复变异最多，其次为点突变，c.83G>A、c.226G>C、c.259delC、c.157dupA变异为尚未报道的新突变，这一发现拓宽了PMD致病基因的变异谱，加深了对PMD的基因型及表型的认识，对其早期诊断并指导遗传咨询和产前诊断有重要临床意义。但本研究样本量偏少且没有进行随访，需要在今后的研究中不断增加样本量并进行长期随访。