支气管哮喘患儿血清小窝蛋白-1水平和叉头框蛋白M1基因表达与气道重塑的相关性

高 健

(河南省儿童医院/郑州儿童医院/郑州大学附属儿童医院/郑州市儿童感染与免疫重点实验室，河南 郑州 450018)

支气管哮喘是一种由炎症细胞介导的慢性呼吸道疾病，严重危害人类健康[1]。支气管哮喘的主要病理改变为气道炎症、气道重塑及平滑肌功能紊乱，其中气道重塑可能是诱发支气管哮喘患者气道高反应、加速患者病情进展的关键因素[2-3]。因此，早期评估支气管哮喘患者气道重塑并积极采取有效的临床治疗措施对改善患者预后至关重要。小窝蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)是广泛表达于胞膜窖上的分泌蛋白，在细胞的分子信号传导及细胞迁移、侵袭等多方面有重要作用[4]。近年研究发现，Cav-1可能在调节气道炎症和保护哮喘方面发挥重要作用，但其具体机制尚不清楚[5]。叉头框蛋白M1(forkhead box M1,FOXM1)基因是FOX基因家族成员，在调控有丝分裂及细胞周期中发挥重要作用[6]。WU等[7]研究显示，FOXM1基因可诱导哮喘患者呼吸道上皮屏障功能障碍。由此可见，Cav-1、FOXM1与哮喘的发生、发展有关，但二者与气道重塑的关系尚不明确。本研究旨在探讨支气管哮喘患儿血清Cav-1、FOXM1水平与气道重塑的相关性，以期为支气管哮喘患儿的病情评估及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2020年1月至2021年7月郑州大学附属儿童医院收治的支气管哮喘患儿为研究对象。病例纳入标准：(1)符合支气管哮喘诊断标准[8]；(2)儿童无哭闹严重现象，依从性较好，可配合完成检测；(3)支气管哮喘病程>1 a，且临床资料完整。排除标准：(1)合并先天性代谢性疾病、急慢性感染性疾病及免疫系统疾病；(2)合并过敏性哮喘或其他严重肺部疾病；(3)伴有重要脏器功能障碍、恶性肿瘤等。本研究共纳入支气管哮喘患儿178例，其中急性发作期92例(急性发作组)、临床缓解期86例(临床缓解组)。急性发作组：男45例，女47例；年龄6～13(9.02±2.32)岁。临床缓解组：男42例，女44例；年龄6～13(9.16±2.19)岁。急性发作期患儿根据病情程度分为轻度组(n=47)和中重度组(n=45)。轻度组：男22例，女25例；年龄6～12(8.98±2.36)岁。中重度组：男23例，女22例；年龄6～13(9.06±2.34)岁。急性发作组与临床缓解组、轻度组与中重度组患儿的性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究通过医院医学伦理委员会批准，患儿监护人均签署知情同意书。

1.2 血清Cav-1水平检测抽取各组患儿入组时清晨空腹静脉血5 mL，室温下静置30～60 min，3 000 r·min-1离心15 min，取上层血清，置于-80 ℃条件下保存待测。采用酶联免疫吸附试验检测血清Cav-1水平，试剂盒购自武汉菲恩生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测血清中FOXM1 mRNA表达取待测血清，应用RNA提取试剂盒(北京康瑞纳生物科技有限公司)提取血清总RNA，采用反转录试剂盒(上海研谨生物科技有限公司)将RNA反转录为cDNA。利用Genbank获得基因号，引物合成由宝生物工程(大连)有限公司完成。FOXM1的上游引物序列为5′-CACAGTACGATACTGCTGTAG-3′，下游引物序列为5′-GTACTCTAGCGGTATGACTCG-3′；以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glycolytic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参基因，GAPDH的上游引物序列为5′-CATATCATCGTGCTACGGATG-3′，下游引物序列为5′-GATCAATACATTCGCAGCTGG-3′。PCR反应体系50 μL：上下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL，SYBR Green Master Mix(江西江蓝纯生物试剂有限公司)25 μL，50 mg·L-1cDNA 5 μL，ddH2O 16 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算血清FOXM1 mRNA的相对表达量。实验重复3次，取均值。

1.4 肺功能检查应用HI-801型肺功能检测仪(日本捷斯特公司)检测患儿肺功能，观察指标包括第1秒用力呼气量(forced expiratory volume in one second,FEV1)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)，计算FEV1/FVC。

1.5 气道重塑指标检测各组患儿均行胸部CT扫描，取主动脉弓及气管分叉上下1 cm、右肺下静脉和横隔顶上2 cm处放大图像，测量支气管内直径和外直径，连续测量2次并取均值，计算支气管管壁厚度与外直径的比值(T/D)及支气管壁占支气管总横截面积的百分比(WA)；T/D=(外直径-内直径)/外直径，WA=(外直径的平方-内直径的平方)/外直径的平方×100%。

2 结果

2.1 急性发作组与临床缓解组患儿血清Cav-1水平及FOXM1 mRNA相对表达量比较结果见表1。急性发作组患儿血清Cav-1水平显著低于临床缓解组，FOXM1 mRNA相对表达量显著高于临床缓解组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 急性发作组与临床缓解组患儿血清Cav-1水平及FOXM1 mRNA相对表达量比较

2.2 急性发作组与临床缓解组患儿肺功能及气道重塑指标比较结果见表2。急性发作组患儿FEV1、FEV1/FVC显著低于临床缓解组，T/D、WA显著高于临床缓解组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 急性发作组与临床缓解组患儿FEV1、FEV1/FVC、T/D及WA比较

2.3 轻度组、中重度组患儿血清Cav-1水平和FOXM1 mRNA相对表达量、肺功能指标及气道重塑指标比较结果见表3。中重度组患儿血清Cav-1水平及FEV1、FEV1/FVC显著低于轻度组，血清中FOXM1 mRNA相对表达量及T/D、WA显著高于轻度组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 轻度组与重度组患儿血清Cav-1水平和FOXM1 mRNA相对表达量、FEV1、FEV1/FVC、T/D及WA比较

2.4 急性发作期支气管哮喘患儿血清Cav-1水平、FOXM1 mRNA表达与肺功能指标、气道重塑指标的相关性结果见表4。Pearson分析结果显示，急性发作期支气管哮喘患儿血清Cav-1水平与FOXM1 mRNA表达呈负相关(r=-0.512，P<0.05)；血清Cav-1水平与FEV1、FEV1/FVC呈正相关，与T/D、WA呈负相关(P<0.05)；血清中FOXM1 mRNA表达水平与FEV1、FEV1/FVC呈负相关，与T/D、WA呈正相关(P<0.05)。

表4 急性发作期支气管哮喘患儿血清Cav-1、FOXM1 mRNA与肺功能指标、气道重塑指标的相关性

3 讨论

支气管哮喘是常见的呼吸道疾病之一，目前对其发病机制仍缺乏全面的认知[9]。支气管哮喘易反复发作且病程较长，在其发病过程中呼吸道内皮组织损伤、平滑肌细胞过度增殖，进而引起气流受限、气道狭窄，导致气道重塑，加重患者病情[10]。既往研究显示，肺功能指标及气道重塑指标改变均是气道重塑的重要特征[11-12]，但二者检测方式复杂，往往造成患儿依从性较差，无法配合。因此，临床中可寻找相关生物学指标来评估支气管哮喘气道重塑情况。

支气管上皮细胞作为肺抵御外界刺激的屏障，其功能异常时可分泌大量的促炎因子，激活中性粒细胞、嗜酸粒细胞等炎症细胞，导致呼吸道慢性炎症及气道重塑的发生与发展[13-15]。因此，支气管上皮细胞受损也是支气管哮喘的重要特征之一。WANG等[16]研究发现，FOXM1基因转录因子水平升高可促进小鼠支气管上皮细胞增殖，提示FOXM1基因在支气管上皮细胞受损中可能有重要作用。本研究结果显示，急性发作期患儿血清中FOXM1 mRNA相对表达量显著高于临床缓解期患儿，且中重度患儿血清中FOXM1 mRNA相对表达量显著高于轻度患儿，提示FOXM1 mRNA表达水平可用于评估支气管哮喘患儿的疾病严重程度，但其发挥作用的具体机制有待今后进一步探究。Pearson分析结果显示，血清中FOXM1 mRNA表达水平与FEV1、FEV1/FVC呈负相关，与T/D、WA呈正相关。在炎症等病理因素作用下，FOXM1 mRNA表达上调，其高表达可参与支气管上皮细胞损伤，造成上皮细胞屏障功能被破坏，诱导大量促炎因子产生和分泌，炎症细胞被激活，进而导致气道重塑及呼吸道炎症的发生。

胞膜窖在质膜上具有高度均匀的结构，近期被描述为杯状结构，其可参与信号转导。Cav-1是胞膜窖的主要结构成分，可在呼吸道平滑肌细胞中表达[17-18]。研究显示，Cav-1可通过影响呼吸道平滑肌细胞内钙离子的浓度而发挥抑制呼吸道炎症作用[19]。本研究结果显示，随着支气管哮喘患儿病情加重，其血清Cav-1表达下调，Cav-1有望成为支气管哮喘抗炎治疗的新靶点。本研究结果显示，急性发作期支气管哮喘患儿血清Cav-1水平与FOXM1 mRNA表达呈负相关；血清Cav-1水平与FEV1、FEV1/FVC呈正相关，与T/D、WA呈负相关；血清中FOXM1 mRNA表达水平与FEV1、FEV1/FVC呈负相关，与T/D、WA呈正相关；提示Cav-1与FOXM1可能通过互相影响，反向刺激，在气道重塑和呼吸道炎症中发挥重要作用，Cav-1水平越低，FOXM1 mRNA水平越高，支气管哮喘病情及气道重塑越严重。

综上所述，Cav-1和FOXM1基因可能共同参与了支气管哮喘患儿的气道重塑。血清Cav-1和FOXM1基因表达水平对判断支气管哮喘患儿病情严重程度有重要价值，为临床治疗提供理论依据。本研究仍存在不足之处，例如：纳入样本量不足可能会对本研究结果造成一定偏倚，需加大样本量继续研究；本研究未动态监测Cav-1、FOXM1 mRNA水平与治疗效果的关系，未能明确二者在临床治疗中的具体作用。