糖肾煎通过促进SIRT1介导的自噬对糖尿病肾病大鼠的治疗作用

晏 玲,牛晓静,张利芳(武汉市中医医院内分泌科,武汉 430014)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常见的慢性并发症,占所有糖尿病患者的20%～40%[1]。DN的发病机制可能与代谢、氧化应激和炎症有关,早期的DN以微量白蛋白尿为特征,当蛋白尿加剧时,由于其具有进行性和不可逆性等特征,使患者出现严重肾功能障碍,并导致死亡率明显增加[2]。虽然已经发现多种机制参与了其发病,并开发了大量治疗性的药物,但DN因其高患病率和较差的预后,依然是世界各国科学家的研究重点。研究证实,人沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是一种组蛋白去乙酰化酶,通过调节代谢稳态和自噬,抵抗凋亡和氧化应激,对细胞起到保护作用,抑制细胞的凋亡[3,4]。SIRT1依赖机制预防高脂饮食(high-fat diet,HFD)诱导的肥胖相关的肾脏损伤[5],且SIRT1作为预防和治疗糖尿病的临床靶点具有巨大的潜力[6]。糖肾煎是治疗2型糖尿病肾病的经典方剂[7],含有黄芪、五味子等多种成分,药效温和,副作用小,动物研究证实其成分五味子等能够降低糖尿病大鼠血糖,升高血清胰岛素水平,降低丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,增强超氧化物歧化(superoxide dismutase,SOD)活力[8],然而,糖肾煎是否能通过自噬途径对DN发挥保护作用,尚不明确。本研究旨在探究中药复方糖肾煎是否通过SIRT1介导的自噬发挥抗糖尿病肾病作用,旨在为DN的治疗提供新的科学资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 60只清洁级(specific pathogen free,SPF)雄性SD大鼠(体质量165～180 g)购于北京维通利华实验动物技术有限公司,大鼠于标准动物房适应性饲养1周,饲育温度(25 ±2)℃,相对湿度(60 ±10)%,自由饮食,按SPF级标准条件饲养。

1.1.2 主要药物和试剂 糖肾煎由生黄芪、太子参、山药、牡丹皮、茯苓、五味子、山茱萸、赤芍、生地黄及三七等中药组成,用“水煮醇提法”制备成浸膏;链脲佐菌素(Streptozocin,STZ;美国Simga公司),二甲双胍(天津药业集团有限公司),大鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)放射免疫试剂盒(上海森雄科技有限公司),血糖检测试剂盒(上海恒远生物),兔抗SIRT1抗体(美国Cell Signaling Technology公司),兔抗核孔蛋白(nuclear pore protein p62,p62;美国Abcam公司)和微管相关蛋白1的轻链3(microtubule-associated protein light chain-3,LC3抗体;美国Abcam公司),兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH;美国Sigma公司),兔抗肌间线蛋白抗体(Desmin;美国ProSci公司),兔抗肾病蛋白抗体(Nephrin;武汉Proteintech),辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(上海碧云天生物技术有限公司),苏木精-伊红染色(HE)染色盒(德国Roche公司),血尿素氮(blood urea,BUN)和血肌酐(serum creatinine,Scr)试剂盒购自上海森雄科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 BX-51显微镜(茂鑫实业(上海)有限公司),CMax Plus酶标仪(美国Biorad公司),垂直电泳仪DYCZ(北京金时速仪器设备有限公司),HS-S7220-B型石蜡切片机(恒松科技有限公司),Tanon 4600凝胶成像仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司),BK-40全自动生化仪(日本日立公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 造模及给药 60只大鼠随机均分为对照组、模型组、糖肾煎组及二甲双胍组。对照组大鼠用普通清洁级饲料喂养,模型组、糖肾煎组及二甲双胍组大鼠,用高糖高脂饲料喂养,饲喂4周,模型组、糖肾煎组及二甲双胍组大鼠于避光下按35 mg/kg一次性腹腔注射1% STZ溶液,对照组大鼠注射等剂量0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶剂,72 h后尾静脉采血,检测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)≥16.7 mmol/L即为糖尿病造模成功;继续饲养1周,收集24 h尿液,检测尿蛋白含量,超过30 mg/24 h,表示DN模型成功。造模成功后进行给药实验,糖肾煎组大鼠10 g/(kg·d)糖肾煎灌胃,二甲双胍组大鼠以生理盐水稀释二甲双胍100 mg/(kg·d)灌胃,对照组和模型组大鼠给予同体积生理盐水灌胃,连续8周。末次给药前1周,于代谢笼收集24 h尿液,测定24 h尿微量白蛋白(microalbuminuria, UAlb)、胱蛋白酶抑制剂(Cystain C,Cys-c)指标;末次给药前禁食不禁水12 h,经腹主动脉抽取各组大鼠外周血检测血清FBG、尿素氮(BUN)、血尿肌酐(Scr)。同时分离大鼠的肾脏组织,进行后续实验分析。

1.2.2 FBG、BUN、SCr和24 h UAlb、Cys-c的测定 末次给药后,将各组大鼠麻醉后腹主动脉取3 ml全血至离心管中分离血清,按试剂盒说明书方法检测FBG、BUN及Scr的表达;同时用代谢笼收集大鼠24 h尿液,采用放射免疫法检测UAlb含量,用免疫比浊法Cys-c含量,均按试剂盒说明测定。

1.2.3 HE染色观察大鼠肾脏组织病理损伤情况 分离得到各组大鼠肾脏组织,4%甲醛溶液固定,石蜡包埋,切片至5 μm,依次脱蜡、二甲苯透化,苏木精染色、氨水返蓝后,进行HE染色;再次脱水透化,中性树胶封片,显微镜下进行病理学观察肾脏组织病理损伤情况。

1.2.4 逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测TNF-α、Desmin、锌指蛋白36(tristetraprolin,TTP)、SIRT1及Nephrin的表达 将各组大鼠处死后,分离大鼠肾脏组织,部分组织封存于冻存管内,液氮过夜转至-80 ℃冰箱备用,取组织100 mg于液氮中研磨,加Trizol 1 ml提取总RNA,使用逆转录试剂盒将RNA逆转录cDNA后,以其为模板进行RT-PCR,RT-PCR总反应体系为20 μl,反应条件为:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性10 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸10 s,40个循环重复,结果采用2-ΔΔCt法计算,基因引物见表1。以GAPDH为内参,检测组织中TNF-α、Desmin、TTP、SIRT1及Nephrin mRNA的表达水平。

1.2.5 Western blot检测SIRT1、LC3、p62、Desmin及Nephrin蛋白表达 在末次给药结束后,分离大鼠肾脏组织,加入含磷酸化酶抑制剂的组织蛋白裂解液于冰上研磨,12 000 r/min离心15 min,参考试剂盒说明书方法使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法对蛋白进行浓度测定,取蛋白30 μg行电泳分离,转至硝酸纤维素膜上,5%脱脂奶粉封闭2 h,加稀释后的SIRT1(1 ∶1 000)、p38-MAPK(1 ∶800)、LC3(1 ∶500)、p62(1 ∶1 000)、Desmin(1 ∶1 000)及Nephrin(1 ∶1 000)一抗,4 ℃孵育过夜;次日PBST洗膜,再加二抗(1 ∶10 000)室温孵育1 h,于凝胶成像系统中成像,使用Image J定量分析;以GAPDH(1 ∶1 000)为内参,检测目的蛋白的表达;实验重复3次。

表1 引物序列

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血清FBG、BUG、SCr及24 h UAlb、Cys-c含量变化

糖尿病肾病模型共造模45只。先构建DM模型，成功43只；再构建DN模型，39只成功用于后续给药实验,模型成模率为87%。给药后，模型组大鼠死亡1只，糖肾煎组和二甲双胍组大鼠没有死亡。与对照组相比,模型组、糖肾煎组和二甲双胍组大鼠血清FBG、BUG、SCr和尿液中24 h-UAlb、Cys-c含量均提高,差异有统计学意义(P<0.05),提示造模成功;糖肾煎组和二甲双胍组大鼠血清FBG、BUG、SCr和24 h尿UAlb、Cys-c含量分别较模型组明显降低(P<0.05),但糖肾煎组上述检测指标水平与二甲双胍组比较,差异均无统计学意义(P>0.05,见表2)。

2.2 肾脏组织病理学特征

对照组大鼠肾脏组织细胞排列整齐,结构完整,细胞核清晰,无病理性改变;与对照组比较,模型组大鼠肾脏组织部分肾小管上皮细胞肿胀、脱落,伴大量炎性细胞浸润,肾小球萎缩,部分肾小球系膜细胞增生;与模型组相比,糖肾煎组和二甲双胍组大鼠肾脏组织部分肾小管颗粒样变性,少量肾小球萎缩,肾小球系膜细胞轻度增生;与二甲双胍组相比,糖肾煎组肾脏组织病理炎症浸润和肾小球萎缩减少,肾小球系膜细胞增生程度降低(见图1)。

表2 各组大鼠血清FBG、BUG、SCr和24 h-UAlb、Cys-c的水平

图1 各组大鼠肾脏组织的病理变化 (HE,×400)Figure 1 Pathological changes of renal tissue in each group (HE,×400)

2.3 肾脏组织TNF-α、Desmin、TTP、SIRT1及Nephrin mRNA水平相对值

RT-PCR实验结果显示,与对照组相比,模型组大鼠肾脏组织Nephrin和SIRT1表达量降低(P<0.05),Desmin、TNF-α和TTP表达量增加(P<0.05);与模型组相比,糖肾煎组和二甲双胍组大鼠肾脏组织Nephrin和SIRT1表达量升高(P<0.05),Desmin、TNF-α及TTP表达量降低(P<0.05,见表3)。

表3 各组大鼠肾脏组织TNF-α、Desmin、TTP、SIRT1及Nephrin mRNA表达

2.4 肾脏组织SIRT1、LC3、p62、Desmin及Nephrin蛋白表达

Western blot检测结果表明,与对照组相比,模型组大鼠肾脏组织SIRT1、Nephrin及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达降低(P<0.05),P62和Desmin表达上调(P<0.05);与模型组相比,糖肾煎组和二甲双胍组大鼠肾脏组织SIRT1、Nephrin及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达升高(P<0.05),P62和Desmin表达量降低(P<0.05);糖肾煎组和二甲双胍组比较上述蛋白变化差异无统计学意义(P>0.05,见图2)。

与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05图2 Western blot检测各组大鼠肾脏组织SIRT1、LC3、P62、Desmin及Nephrin蛋白的表达Figure 2 Protein expression of SIRT1,LC3,P62,Desmin and Nephrin in renal tissue in each group by Western blot

3 讨论

DN是终末期肾病的主要病因,然而,到目前为止,肾移植和药物联用作为DN常用的治疗手段,对改善疾病进展的疗效欠佳[9]。DN的病理学改变可体现在肾小球、小管、间质与血管中,其中肾小球缺陷是最重要的病变,以及随后导致的肾小球滤过率降低等[10]。同时,DN肾小管上皮细胞可发生肥大、凋亡和/或转化为间充质细胞[11-13],此外,肾小球间质被大量炎性细胞和成纤维细胞浸润所造成的间质纤维化和肾小球硬化也是导致肾功能衰竭的重要病变过程[14]。糖肾煎是由临床经验所得,其中药成分丰富,例如包含利水消肿的黄芪,补肾益肝的山茱萸,补肾宁心的五味子,养阴生津、清热凉血的生地等[15],对血糖的降低和肾功能的保护与调节起到重要作用。

自噬是一种维持细胞内稳态的保护机制,但由于上述途径的激活常导致自噬功能的受损,这将加重肾细胞功能障碍和凋亡。在糖尿病环境中,细胞自噬缺陷可诱导不同肾细胞的病变,并进一步促进肾脏疾病的进展[16,17],LC3是最早发现的自噬标记物,其中LC3-Ⅰ广泛分布于细胞浆内,当自噬体形成时,与其膜上的磷脂共价结合,转变为LC3-Ⅱ,因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值常被用来反映自噬水平的高低[18]。另外,作为自噬底物的泛素结合蛋白p62,是自噬的首选靶位,其表达水平水平与自噬呈负相关[19]。

研究发现SIRT1基因与UAlb/Scr比值有关。糖肾煎逆转代谢和生化特征的改变,如降低Scr和BUN水平,这涉及激活肾细胞中的核因子κB(NF-κB)通路,特别是内皮细胞(ECs),它能分泌黏附分子,趋化因子等[20,21]。研究提示长期高血糖刺激会引起TNF-α高表达,并进一步导致免疫调节的紊乱。DN患者体内TNF-α表达异常增加,依据TNF-α和UAlb与肾脏损伤呈正相关原理,TNF-α可作为DN早期诊断的依据[22]。肾脏是唯一清除Cys-c的器官,Cys-c可以经肾小球自由滤过,在DN检测过程中优于Cr[21,23]。足细胞损伤被认为是蛋白尿和肾小球疾病的主要原因[24-25],而Desmin和Nephrin是典型的足细胞损伤标记物,Nephrin基因突变导致蛋白尿产生和先天性肾病综合征,此外,Desmin的高表达及其表型转化常导致足细胞细胞骨架的重排[26]。TTP是一种RNA结合蛋白,其水平常用来反映糖尿病患者在DN发生前的微炎症状态[27]。本研究发现,糖肾煎对于DN大鼠的治疗效果明显改善,与DN大鼠相比,糖肾煎有效降低UAlb、FBG、Scr和BUN血尿指标,TTP、TNF-α、Cys-c和Desmin等组织标志因子的明显降低,SIRT1、Nephrin和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达的上调,以及p62自噬标志物表达的显著降低也充分表明了对细胞的改善和保护作用。

综上所述,本研究结果表明糖肾煎对DN起到保护和治疗作用,这可能与SIRT介导的细胞自噬机制有关。