生长分化因子8调控女性生殖生理活动及生殖疾病相关分子机制的研究进展

2022-03-21刘博群方兰兰

生殖医学杂志 2022年3期

刘博群，方兰兰

(郑州大学第一附属医院生殖与遗传专科医院，郑州 450052)

生长分化因子8(GDF-8)在全身各个组织广泛分布且发挥着重要作用，其参与调节骨骼肌发育、脂类和蛋白质代谢。自从2012年首次报道血清GDF-8水平与PCOS患者腹部肥胖呈正相关[1]，此后，越来越多的研究关注于GDF-8在女性生殖系统中的作用和机理。GDF-8参与调控女性生殖生理过程，如卵泡发育、排卵、卵巢类固醇激素合成、胚胎着床及胎盘发育，同时，还参与生殖相关疾病的发生，如多囊卵巢综合征(PCOS)[2]、子宫肌瘤[3]、先兆子痫[4]。此外，GDF-8还参与不孕症患者妊娠结局的调控。本文将从GDF-8对卵泡发育、排卵、胎盘功能调控、女性生殖疾病调控和辅助生殖技术应用中的作用等方面进行综述，以期为女性生殖生理机制的深入研究以及相关疾病诊疗新策略的提出提供重要科学依据。

一、GDF-8的概况

1.GDF-8的发现与结构：McPherron等[5]首次发现了转化生长因子β(TGF-β)家族的新成员GDF-8，GDF-8敲除小鼠的肌肉量大约是野生型小鼠的2倍，鉴于GDF-8作用是抑制骨骼肌生长和分化，因此又被称为肌肉生长抑制素(Myostatin)。随后，在牛、羊、狗等物种中也发现GDF-8缺陷促使肌肉量增加[6]。Schuelke等[7]在患有肌肉肥大的患儿中发现了GDF-8突变，说明GDF-8在人体中同样具有抑制骨骼肌生长的作用。

GDF-8属于TGF-β超家族成员，由位于人类2号染色体长臂32.2位的MSTN基因编码。最初合成的GDF-8前体蛋白大小为52 kDa，其具有N端分泌信号、前肽结构域和C端RSRR(Arg-Ser-Arg-Arg)蛋白水解位点，该前体蛋白需要经过两次蛋白水解才能形成有活性的GDF-8[8]。成熟的GDF-8分子量为25.0 kDa，为二聚体分泌型多肽，在人类、小鼠、大鼠、猪、鸡、火鸡和狗中具有高度同源性。

2.GDF-8的受体和信号通路：TGF-β家族受体包含高亲和力的Ⅱ型受体和低亲和力的Ⅰ型受体，两种受体亚型具有相似的结构和丝氨酸/苏氨酸激酶活性。目前，已知有7种Ⅰ型受体，分别为激活素受体样激酶1-7(ALK1-7)和5种Ⅱ型受体，分别为ACVR2A、ACVR2B、TβR2、BMPR2和AMHR2[9]。与GDF-8结合的Ⅰ型受体是ALK4和ALK5，与GDF-8结合的Ⅱ型受体是ACVR2A和ACVR2B[6]。

GDF-8可激活Smad依赖和Smad非依赖信号通路[8]。GDF-8与Ⅱ型受体结合激活Ⅰ型受体，磷酸化Smad2/3并与Smad4结合形成复合物调控核内靶基因，抑制性Smad7可消除GDF-8信号。此外，GDF-8还可以激活ERK、p38 MAPK和JNK等Smad非依赖信号通路[8]。

3.GDF-8在生殖系统中的表达：GDF-8及其受体在人卵巢中均有表达，且在颗粒细胞中的含量最高[10]，卵泡液中也可以检测到GDF-8[11]。研究发现，GDF-8在人胎盘中的表达量随孕周的增加而显著下降[12]，在人子宫肌层和内膜中也有GDF-8及其受体的表达[13-14]，而人输卵管中是否有GDF-8表达尚未有报道。

二、GDF-8参与生殖生理活动调控

1.GDF-8参与颗粒细胞增生：结缔组织生长因子(CTGF)在人卵泡颗粒细胞中高表达，是卵泡膜细胞招募、卵泡发育和黄体血管形成过程中的关键蛋白[15]。Chang等[16]研究发现，GDF-8和CTGF显著抑制人黄素化颗粒细胞(HGL)的增殖，GDF-8通过ALK 4/5介导的Smad 2/3信号通路上调CTGF的表达，该促进作用与GDF-8浓度呈正相关，此外，靶向敲除CTGF可以逆转GDF-8对HGL细胞的抑制作用，从而证实了GDF-8对HGL细胞增殖负性调节作用的机制。

2.GDF-8对卵巢类固醇激素生成的调控作用：Cheewasopit等[17]研究发现，在牛颗粒细胞中GDF-8增加基础芳香化酶(Aromatase)的表达和E2分泌，降低基础和FSH诱导的3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)的表达和孕酮分泌；在卵泡膜细胞中，GDF-8抑制基础和LH刺激的雄激素分泌，而不影响孕酮分泌。我们团队之前研究发现，在HGL细胞中GDF-8通过ALK5介导Smad2/3信号通路上调Aromatase的表达并增加E2水平[18]，增加FSH受体水平来增强FSH的效应。同时，GDF-8通过ALK5介导的Smad3和ERK1/2信号通路，下调类固醇急性调节蛋白(StAR)的表达并减少孕酮的产生。GDF-8通过减少LH受体水平来减弱LH的效应，且不影响细胞中P450侧链切割酶和3β-HSD的表达。GDF-8通过抑制排卵前卵泡晚期孕酮的生成，在预防黄体过早形成发挥着关键作用，这一重要的生理功能用于维持卵泡生长和体细胞增殖[19-20]。GDF-8对HGL细胞类固醇激素合成的调控过程见图1。

图1 GDF-8对HGL细胞类固醇激素合成的调控过程示意图

3.GDF-8参与卵丘扩张：正五聚体蛋白(PTX3)是PTX家族的经典蛋白，有聚合作用，参与形成稳定的透明质酸网络，有助于细胞外基质组装与卵丘扩张[21]。El-magd等[22]用腺相关病毒携带MSTN前肽(AAV-MSTNP)作为GDF-8抑制剂，发现在水牛卵母细胞体外成熟(IVM)中，AAV-MSTNP下调PTX3并抑制卵丘扩张。而我们研究证实，在人颗粒细胞中GDF-8通过ACVR2A/ACVR2B-ALK5介导的Smad信号通路下调PTX3的表达，抑制卵丘扩张，在排卵前减数分裂停滞后起着维持卵丘的作用[11]。

4.GDF-8与卵母细胞成熟：在猪卵母细胞IVM中，培养基补充GDF-8会激活P38 MAPK信号通路从而改变卵母细胞成熟相关基因的转录水平，使细胞内ROS水平下降，促进卵母细胞成熟[23]。之后研究者还发现，GDF-8也可以通过Smad2/3信号通路促进减数分裂和细胞质成熟[24]。在水牛卵母细胞IVM中，通过观察卵母细胞IVM效率和卵丘-卵母细胞复合体中特异性基因的表达情况发现，GDF-8抑制剂可显著降低卵母细胞的成熟率，使达到减数分裂中期的卵母细胞减少，并伴随着相关凋亡基因的表达上调，抗凋亡基因的表达下调[22]。在人卵巢中GDF-8可以促进颗粒细胞赖氨酸氧化酶(LOX)的表达及活性[25]，而LOX在卵泡发育过程中可以稳定细胞外基质，是优质卵母细胞的标志物[26]，提示GDF-8参与促进卵母细胞成熟。

5.GDF-8参与调控胚胎发育：Yoon等[27]研究发现，在猪胚胎体外培养中外源性GDF-8通过改变基因的转录模式，从而增强内细胞团标记物SOX2的表达和内细胞团/滋养外胚层比例以提高体外受精中的囊胚质量。El-magd等[22]研究表明，GDF-8抑制剂作用于体外培养的水牛卵母细胞后，其受精效率、卵裂率和囊胚率显著下降。此外，Wong等[28]研究发现，GDF-8可以促进金仓鼠体外培养的胚胎滋养层的增殖与孵化、抑制附着，其抑制附着是通过干扰胚胎着床蛋白酶表达或减弱子宫内膜上皮细胞产生的白血病抑制因子发挥作用的。因此，GDF-8参与植入前胚胎发育过程，而GDF-8在人体胚胎调控中的作用尚无研究。

6.GDF-8参与调控胎盘功能：Peiris等[29]用不同浓度的GDF-8处理人原代绒毛膜滋养层细胞(EVT)及其细胞系(HTR-8/Svneo)发现，GDF-8促进EVT和HTR-8的增殖与迁移，EVT和HTR-8的增殖与GDF-8剂量相关，而迁徙无剂量依赖性。GDF-8在调控滋养层细胞侵袭中的作用尚有争议。卵泡抑制素样3(FSTL3)是GDF-8拮抗剂[30]，可显著促进滋养层的侵袭和脂质储存，抑制滋养层的凋亡，而研究发现，GDF-8通过ALK5-Smad2/3信号通路上调FSTL3的表达并促进滋养层细胞侵袭[31-32]。Mitchell等[12]通过体外放射标记脱氧葡萄糖评估胎盘组织葡萄糖摄取发现，GDF-8促进人胎盘组织的葡萄糖代谢，有助于胎盘葡萄糖稳态，可能是治疗胎盘功能不全、妊娠糖尿病等疾病的靶点。Antony等[33]研究发现，GDF-8抑制绒毛膜癌细胞系(BeWo细胞)的葡萄糖摄取。以上两项研究结果的差异可能由于原代滋养细胞和细胞系在基因表达、甲基化模式和HLA分子表达方面存在差异。

三、GDF-8参与的女性生殖疾病

1.多囊卵巢综合征(PCOS)：PCOS是不孕症患者最常见的原因之一，其鹿特丹诊断标准[34]为稀发排卵或无排卵、临床/生化高雄激素血症、多囊卵巢的超声表现，满足两个及以上者即可诊断。研究发现，PCOS患者卵巢窦卵泡中GDF-8及其受体水平增加[10]，卵泡液中GDF-8水平较高[2]，而血清GDF-8水平无显著变化[1，35]。有研究发现，PCOS患者卵泡液GDF-8表达水平高于血清，说明其作为卵巢源性因子参与PCOS的发生[2]。Bai等[36]研究发现，在PCOS患者中GDF-8通过ALK5介导的Smad2/3信号通路上调人纤溶酶原激活物抑制剂1(SERPINE1)的表达，从而对颗粒细胞造成葡萄糖代谢损伤，并使得PCOS患者代谢紊乱。

2.卵巢癌：在卵巢癌中E-钙黏蛋白(E-cadherin)下调参与上皮间充质转化(EMT)过程，即上皮细胞失去粘附而获得迁移和侵袭特性[37]。Zhao等[38]研究发现，GDF-8激活ALK4/5-Smad2/3信号通路下调E-cadherin的表达，上调EMT的重要转录因子Snail和Slug的表达，参与卵巢癌细胞的扩散转移。

3.子宫肌瘤：子宫平滑肌瘤是女性最常见的良性肿瘤。研究发现，GDF-8在人类平滑肌瘤中较正常子宫肌细胞表达升高[39]。Islam等[3]用GDF-8处理子宫原代肌层细胞和肌瘤细胞后发现，GDF-8通过激活Smad2/3信号通路降低子宫肌层细胞增殖细胞核抗原和Ki-67表达，发挥抗纤维化的作用，而不影响肌瘤细胞的增殖，有可能为子宫肌瘤分子诊疗措施的提出提供依据。

4.子宫腺肌症：子宫腺肌症好发于绝经前妇女，主要症状有异常子宫出血(AUB)，低生育能力和较高的流产率[40]。研究发现，GDF-8及其Ⅱ型受体在子宫腺肌症中高表达，推测GDF-8受体扩增可能在腺肌症导致的不孕中发挥作用[41]。Harmsen等[42]研究发现，腺肌症组患者GDF-8的表达水平高于对照组，这提示GDF-8参与子宫脆性和渗透性较高血管的生成过程，可能与腺肌病相关的AUB和生育能力低下有关，为该疾病提供了一个可能的治疗靶点。

5.子宫内膜肿瘤：GDF-8及其受体在正常子宫内膜以及内膜良恶性肿瘤中表达存在差异。GDF-8及受体在良性肿瘤，如卵巢子宫内膜瘤(OMA)和子宫内膜息肉中表达升高。GDF-8在深浸润性子宫内膜异位症(DIE)和子宫内膜癌中表达最高，而GDF-8受体在子宫内膜癌和腺癌中的表达最高。GDF-8及其受体的这种差异性分布提示，GDF-8参与了人类子宫内膜相关病理[14]，但为了更好地理解GDF-8及其相关蛋白在子宫内膜生理和病理中的作用，还需要进一步的研究。

6.妊娠期糖尿病(GDM)：GDM是指妊娠期母体葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗。Peiris等[43]研究发现，GDM患者血清GDF-8水平与正常妊娠组相比无显著差异，而胎盘中GDM患者GDF-8水平显著低于正常妊娠组。经胰岛素治疗组患者胎盘GDF-8水平高于饮食疗法组，更接近正常对照组。由此，Peiris等[43]提出，GDF-8于胎盘组织的表达在应激条件下(如糖代谢异常)发生改变，通过影响胎盘组织葡萄糖稳态，改变胎盘的功能，可能与GDM的葡萄糖耐受不良相关。

7.子痫前期(PE)和宫内生长受限(IUGR)：PE和IUGR是导致母体、胎儿和新生儿预后不良的主要妊娠疾病。研究证实，GDF-8在PE、IUGR以及PE合并IUGR孕妇血清和胎盘中显著升高[4]。在体外培养胎盘组织中，GDF-8治疗促使妊娠早期胎盘组织产生的细胞因子发生改变，即从Th1细胞因子(促炎)环境转移到成功妊娠所需的Th2细胞因子(抗炎)环境，说明GDF-8在合并PE和IUGR的复杂妊娠中发挥有利作用[4]。

四、GDF-8在辅助生殖中的作用

研究发现，在接受IVF助孕患者控制性超促排卵(COH)过程中，妊娠组与非妊娠组血清GDF-8水平动态变化趋势相似，但在HCG日和ET后14 d血清GDF-8水平有显著差异，提示血清GDF-8水平与妊娠结果关系密切[44]。目前，已知HCG日孕酮提前升高可以降低胚胎着床率、妊娠率和活产率，且血清GDF-8水平与孕酮水平呈负相关[19，45]。由此，我们推测GDF-8变化预测妊娠结局的主要机制为：在HCG使用前，较高水平的GDF-8通过保持较低的血清孕酮水平对妊娠有利；而HCG作用后，低水平的GDF-8维持高水平的孕酮对早期胚胎着床至关重要，因此，血清GDF-8水平是IVF/ICSI-ET治疗患者妊娠的一个有价值的预测因子[44]。

另外，在IVF过程中PCOS患者卵泡液GDF-8水平显著高于非PCOS患者，颗粒细胞中基础ALK5水平增加，而StAR水平降低，且GDF-8对StAR的抑制作用更加显著[2]。GDF-8和ALK5的高基础表达水平可能导致PCOS患者颗粒细胞中StAR和孕酮异常下调，这可能导致不良的妊娠结局。相比之下，在非PCOS患者中，通过保持相对较低StAR和孕酮水平以防止过早黄素化，较高水平的GDF-8可能对妊娠有益，因此，GDF-8在PCOS患者卵泡液中的异常表达可能是治疗PCOS的潜在新靶点[2]。