D6非优质冻融囊胚移植策略的探讨

彭姝明，刘海鹏，李苏萍，杨帆，段丽

(郴州市第一人民医院生殖医学中心，郴州 423000)

众所周知，冻融囊胚移植的临床妊娠率显著优于常规的冻融卵裂胚移植[1-3]。目前，大多数生殖中心通常会建议患者先冻存2枚或更多的优质第3天(D3)卵裂胚，然后将剩余的D3可利用卵裂胚行囊胚培养以获得囊胚用于移植或者冻存。选择性单个优质囊胚移植是目前推荐的最佳冻融囊胚移植策略。然而，对于非优质囊胚，尤其是第6天(D6)非优质囊胚的移植策略依然并不明确。研究发现，D6冻融囊胚移植的临床妊娠率显著低于第5天(D5)冻融囊胚移植[4-5]。广大辅助生殖技术(ART)工作者对于D5冻融囊胚移植和D6优质冻融囊胚移植所获取的临床结局是满意的，然而，对D6非优质冻融囊胚移植的临床妊娠结局却不是很满意。对于有D3优质卵裂胚冻存而只能获取D6非优质囊胚的患者或者只剩余D6非优质囊胚和D3优质卵裂胚的患者群体而言，如何尽可能的为患者争取最佳的临床结局？在此情形下制订最佳的胚胎移植策略是亟需解决的问题。为了研究D6非优质冻融囊胚的移植策略是否完善，本研究回顾性分析了2016年9月至2020年7月于我中心行不同冻融胚胎移植方案的临床结局，试图为完善和优化D6非优质冻融囊胚的移植策略提供新的思路。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2016年9月至2020年7月于我中心行冻融胚胎移植患者的临床资料。

纳入标准：(1)年龄≤42岁；(2)基础FSH<12 U/L；(3)18.5 kg/m2<体质量指数(BMI)<24 kg/m2。排除标准：可能影响患者正常妊娠的疾病，如先天遗传异常、生殖道畸形、反复流产史等。

共纳入803个周期。鉴于年龄是影响ART患者妊娠结局的独立因子，根据患者年龄分为年龄<36岁组(n=429)和年龄≥36岁组(n=374)；各年龄段患者再根据不同的胚胎移植策略分为3组：移植D3优质冻融双卵裂胚的为A组，移植D6非优质冻融单囊胚的为B组，移植D6非优质冻融双囊胚的为C组。

二、研究方法

1.子宫内膜准备方案：(1)激素替代周期，适用于月经周期不规律的患者。递增法口服戊酸雌二醇(补佳乐，拜耳，德国)，月经第2～4天开始口服4 mg/d，每4 d递增8 mg；12 d后监测内膜厚度、血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平，酌情调整补佳乐剂量；当子宫内膜厚度≥7 mm、血清E2≥735 pmol/L、P<3.14 nmol/L时，肌肉注射黄体酮(浙江仙琚)60 mg，1次/d，至胚胎移植日。把开始黄体转换日定为起始日，卵裂胚移植于黄体酮注射的第5天行D3卵裂胎移植，囊胚移植于第6天行D6囊胚移植。(2)自然周期，适用于月经规律患者。冻融囊胚患者从月经第11天开始行阴道B超监测排卵，排卵日定为起始日，于起始日开始肌肉注射黄体酮40 mg，1次/d，至胚胎移植日，在排卵后第5天行D6囊胚移植。冻融卵裂胚移植患者从月经的第10天开始监测卵泡的发育及子宫内膜情况，当卵泡>15 mm时，监测血清LH、E2及P水平判断具体排卵日期，当子宫内膜≥8 mm定为起始日，肌肉注射黄体酮40 mg/d行黄体支持，注射的第4天行D3冻融卵裂期胚胎移植。

2.冻融胚胎的解冻及培养：(1)D3冻存卵裂胚的解冻及培养：移植前一天下午进行卵裂胚的解冻，采用玻璃化复苏试剂盒(Vitrification VT102，KITAZATO，日本)，将载杆在液氮中取掉套管后拿出，迅速置于解冻液(TS)中室温放置1 min，然后移入稀释液(DS)中3 min，洗涤液1(WS1)中5 min，洗涤液2(WS2)中5 min。卵裂胚复苏后采用序贯系列培养液(Vitrolife-G5，Vitrolife，瑞典)继续培养。卵裂胚解冻后转入囊胚培养液(G2)并观察评分后，置三气培养箱(Forma 3131，美国)内于37℃、6% CO2、5% O2条件下培养，继续培养至第2天上午激光辅助孵化后行胚胎移植。(2)冻存囊胚的解冻及培养。于移植日上午解冻囊胚，解冻培养步骤同上。将解冻的囊胚转入囊胚培养液(G2)，进行胚胎观察后置三气培养箱内培养2 h后移植。

3.胚胎评价标准：卵母细胞正常受精后第3天观察胚胎形态，根据胚胎卵裂球的数目、均一度和碎片比例评估胚胎。我中心将D3卵裂球为7～9个、无大小不均或轻度不均且碎片<20%的卵裂期胚胎定义为D3优质卵裂期胚胎。卵裂胚复苏后卵裂球存活率≥50%即视为复苏存活卵裂胚。受精5～6天后观察囊胚形态，按照经典的Gardner囊胚评分标准[6]，根据囊胚腔的大小、内细胞团细胞的数量及形态、滋养层细胞的数量及形态等3个方面对囊胚进行评级。本中心将囊胚腔扩张程度为4～6期、内细胞团或滋养层评分至少包含1个C级囊胚定义为D6非优质囊胚。

4.妊娠结局的判断：卵裂胚移植后14 d或者囊胚移植后11 d测血清HCG，血清HCG>5 U/L定义为HCG阳性；胚胎移植后4周，经超声检查见孕囊或见胎心搏动则判定为临床妊娠。

5.观察指标：观察各组患者的一般资料和胚胎复苏率、临床妊娠率、胚胎种植率、流产率、多胎妊娠率和活产率。胚胎复苏率=复苏存活胚胎数/解冻胚胎数×100%，临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%，胚胎种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%，流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%，多胎妊娠率=超过1个孕囊的妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%，活产率=分娩胎儿的周期数/移植周期数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、一般情况比较

本研究共纳入803个周期，其中年龄<36岁组429周期，年龄≥36岁组374周期。同年龄段中各组间平均年龄、基础FSH、移植日内膜厚度和BMI比较均无显著差异(P>0.05)；而A组人工周期占比显著低于B组和C组，自然周期占比显著高于B组和C组(P<0.05)(表1)。

表1 不同年龄患者各组一般资料比较[(-±s)，n(%)]

二、不同年龄段各组间胚胎复苏情况和临床妊娠结局比较

在<36岁年龄段中，各组间胚胎复苏率、临床妊娠率、流产率和活产率比较均无显著差异(P>0.05)，而B组和C组胚胎种植率均显著高于A组(P<0.05)，B组的多胎妊娠率显著低于A组和C组(P<0.05)(表2)。

表2 <36岁患者各组间复苏情况及临床结局比较(%)

在≥36岁年龄段中，各组间胚胎复苏率比较均无显著差异(P>0.05)，A组和C组的临床妊娠率、活产率均显著高于B组(P<0.05)，A组和C组的胚胎种植率显著低于B组(P<0.05)，C组的多胎妊娠率显著高于A组和B组(P<0.05)(表3)。

表3 ≥36岁患者各组间复苏情况及临床结局比较(%)

讨 论

在ART日渐成熟的今天，获取临床妊娠的效率依旧不能令人满意，囊胚移植是提升ART效率的有力手段之一。但直至今日依然没有任何可靠的预测因子来预估囊胚的形成[7-9]，这也是困扰ART工作者的一大难题。目前，由于缺乏可靠的预测指标，在临床工作中通常是选择冻存数枚优质D3卵裂胚，剩余的可利用卵裂胚则用来培养囊胚；或者先移植卵裂胚，剩余的卵裂胚或冷冻或用来培养囊胚。然而，囊胚培养的成功率却并不令人满意。研究表明，有2%～40%的患者可能因为无囊胚形成而被迫取消囊胚移植[10-11]。当获得可利用囊胚后，制订最佳的囊胚移植策略是重中之重。目前，主流的囊胚移植策略是选择性单囊胚移植，以其满意的临床妊娠率和较低的多胎妊娠率为广大ART工作者所接受[12-13]。但必须指出的是，选择性单囊胚移植事实上指的是单个优质囊胚移植的胚胎移植策略，那么未能获取优质囊胚患者的囊胚移植策略该如何制订？以往的研究证明，单个D5或D6优质囊胚移植的临床结局都令人满意，且D5非优质单囊胚的临床结局也非常不错，而D6非优质单囊胚移植的临床结局相对而言就不是很理想[14-16]。我们曾经尝试通过增加D6非优质囊胚移植数目(例如双囊胚移植)来提升临床妊娠率和活产率，但随之也带来了多胎妊娠问题。在只有D6非优质可利用囊胚的情况下如何制订最佳的囊胚移植策略以获取最佳的临床结局，这是困扰我们的一大难题。

本研究结果证实，当患者年龄<36岁时，D6非优单囊胚移植、D6非优双囊胚移植和D3优质双卵裂胚移植3种胚胎移植策略所获得的临床妊娠率比较无显著差异(P>0.05)，D6非优单囊胚移植组和D6非优双囊胚移植的胚胎种植率均显著高于D3优质双卵裂胚移植组(P<0.05)，各组间活产率比较无显著性差异(P>0.05)，但D6非优单囊胚移植组的多胎妊娠率显著低于其他两组(P<0.05)。以上结果表明，对于年龄<36岁的患者而言冻融D6非优单囊胚移植仍然是最佳的冻融胚胎移植策略。当患者年龄≥36岁时，3种冻融胚胎移植策略的数据则发生了变化。D6非优单囊胚移植组的临床妊娠率、活产率均显著低于其他两组(P<0.05)；D3优质双卵裂胚移植组多胎妊娠率与D6非优单囊胚移植组比较无显著差异(P>0.05)，而D6非优双囊胚移植组的多胎妊娠率(45.90%)则仍然维持在非常高的水平，显著高于其他两组(P<0.05)。以上结果表明，当患者年龄≥36岁时，D6非优单囊胚移植已经不能够提供最好的临床结局。虽然可以通过双囊胚移植的策略来提升临床妊娠率和活产率，但是居高不下的多胎妊娠率使得该移植策略的可行性受阻。多胎妊娠实际上是ART的一种并发症，而且多胎妊娠对于患者的临床结局有着诸多不利影响。尤其对于高龄患者(年龄≥36岁)而言，获取临床妊娠的几率本就相对较低，多胎妊娠对于高龄患者的危害也是不言而喻的。本研究发现，对于高龄患者(年龄≥36岁)D6冻融非优双囊胚的移植策略并不值得推荐，而D3冻融优质双卵裂胚移植策略是可行的胚胎移植策略，即在保证了令人满意临床妊娠率和活产率的前提条件下，又将多胎妊娠率降到了一个可以接受的水平(10%左右)，这无疑是高龄患者可以接受的冻融胚胎移植策略。

众所周知，D3优质卵裂胚行囊胚培养的可利用囊胚形成率是非常可观的[9]。以我中心的囊胚培养数据为例，D3优质卵裂胚行囊胚培养的可利用囊胚形成率在65%～70%，其中获取优质囊胚的几率在40%左右，获取D5可利用囊胚的几率在45%左右。以上结果说明，移植2枚D3优质卵裂胚通常情况下有相当大的几率形成至少1枚可利用囊胚。这可能是D3冻融优质双卵裂胚移植的临床妊娠率和活产率不低于D6冻融非优囊胚移植的合理解释。此外，年龄也是一个影响囊胚形成的关键因素。对于年龄≥36岁的高龄患者而言，囊胚培养获得可利用囊胚的几率也在逐渐下降，这可能是年龄≥36岁的高龄患者冻融D3优质双卵裂胚移植多胎妊娠率显著低于D6非优质双囊胚移植的原因。

本研究尚存在不足之处，如本研究为单中心的回顾性分析，缺乏大样本前瞻性研究数据佐证。另外，本研究纳入的患者大多数年龄≤40岁，纳入年龄>40岁的高龄患者较少，对于高龄患者的移植策略还有待于扩大样本进一步深入研究。

综上所述，本中心总结推荐对于只有D3优质双卵裂胚和D6非优质囊胚冻存的患者，当患者年龄<36岁时，可采用D6冻融非优单囊胚移植方案；当患者年龄≥36岁时，可选D3冻融优质双卵裂胚移植方案。