高效液相色谱-串联质谱法同时检测中药软膏剂中9 种糖皮质激素

2022-03-21杜远东穆思芊赵重博

中国药业 2022年5期

杜远东，穆思芊，丁伟，赵重博

（1.陕西省汉中市食品药品监督检验检测中心，陕西汉中 723000； 2.陕西中医药大学，陕西咸阳 712046）

近年来，中成药或保健食品中检测出非法添加化学药的现象时有发生，特别是中药软膏制剂中非法添加糖皮质激素类药物的现象突出。糖皮质激素是由肾上腺皮质分泌的一类甾体类化合物，与糖、脂肪、蛋白质的代谢和生长发育密切相关，具有抗感染、抗过敏、抑制免疫反应等多种药理学作用［1］，临床主要用于治疗肾上腺皮质功能紊乱，自身免疫性疾病如肾病型慢性肾炎、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎，变态反应性疾病如支气管哮喘、感染性疾病、休克，器官移植的排异反应，眼科疾病［2］，尤其适用于皮肤炎症，长期使用会产生瘢痕、皮炎、感染等严重副作用，危害人体健康［3］。常用于检测中成药中非法添加化学药物的方法有物理化学鉴别法、薄层色谱法、高效液相色谱法、液质联用法、红外光谱法、拉曼光谱法等［4-9］，目前主要采用高效液相色谱法和液质联用法［10-12］检测食品、药品、化妆品中糖皮质激素等非法添加成分。由于中药软膏剂基质复杂，已有药品中糖皮质激素的检测方法难以对其进行准确、快速筛查。本研究中建立了适用于日常监督检查中快速检测中药软膏制剂中氢化可的松、曲安奈德、氟轻松、曲安奈德醋酸酯、氟轻松醋酸酯、倍他米松戊酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松双丙酸酯、倍氯米松双丙酸酯9 种糖皮质激素的高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC - 20AT 型高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；API 3200 型三重四极杆质谱仪，配有Analyst1.6 工作站，电喷雾离子源（ESI，美国AB 公司）；BT 261 型电子分析天平（瑞士梅特勒公司，精度为十万分之一）；Nexpower 1000 型纯化水仪（韩国Human 公司）；Transferpette 型可调移液器（德国Brand 公司）；KQ - 250DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为40 kHz）；TG16-WS型离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；MX -E 型涡旋仪（大龙兴创实验仪器＜北京＞有限公司）。

1.2 试药

甲醇、乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；甲酸（色谱纯，成都科龙化工试剂厂）；水为实验室自制一级水。氢化可的松对照品（批号为100152 - 201707，纯度为99.2%），曲安奈德对照品（批号为100055 -201804，纯度为98.8%），曲安奈德醋酸酯对照品（批号为100125 - 201406，纯度为99.1%），氟轻松醋酸酯对照品（批号为100010-201108，纯度为99.6%），倍他米松戊酸酯对照品（批号为510017 - 201301，纯度为99.5%），氯倍他索丙酸酯对照品（批号为100302 -201804，纯度为99.2%），倍他米松双丙酸酯对照品（批号为100596 - 201902，纯度为99.2%），倍氯米松双丙酸酯对照品（批号为100119-201805，纯度为98.8%），均购于中国食品药品检定研究院；氟轻松对照品（迈迪嘉＜天津＞科技有限公司，批号为ALT600756，纯度为98.1%）。中药软膏样品信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Shimadzu Shim - pack VP - ODS C18柱（150 mm × 2.1 mm，3 µm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），梯度洗脱（0～2 min 时5%B →55%B，2～6 min 时55%B →85%B，6～7 min 时85%B →5%B，7～10 min 时5%B）；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5µL。

2.1.2 质谱条件

离子源：ESI，多重反应监测，正离子扫描；离子化电压：5 500 V；温度：550 ℃；气帘气：30 psi；喷雾气：50 psi；辅助加热气：55 psi；碰撞气：氮气；碰撞池入口电压：10 V；碰撞池出口电压：3 V。被测组分相关质谱参数见表2。

表2 9种糖皮质激素的相关质谱参数Tab.2 LC-MS/MS parameters of nine glucocorticoids

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：分别取氢化可的松、曲安奈德、氟轻松、曲安奈德醋酸酯、氟轻松醋酸酯、倍他米松戊酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松双丙酸酯、倍氯米松双丙酸酯对照品各10 mg，精密称定，分别置25 mL棕色容量瓶中，加乙腈溶解并定容，摇匀，制成质量浓度为400 µg/ mL 的对照品贮备液；分别精密量取各对照品贮备液适量，加乙腈稀释成质量浓度为50µg/mL 的混合对照品溶液。

供试品溶液：取混合均匀的样品0.2 g，精密称定，置10 mL 具塞比色管中，加入饱和氯化钠溶液1 mL，涡旋30 s，再加入乙腈2 mL，涡旋30 s，加入乙腈近刻度，超声提取30 min，冷却至室温，加入乙腈定容，摇匀，以4 000 r/min 的转速离心10 min，取上清液，0.22µm 滤膜滤过，取续滤液，即得。

基质标准曲线溶液：取上述混合对照品溶液，逐级稀释成质量浓度为20.0，10.0，4.0，2.0，0.5，0.2µg/mL的系列标准溶液。将不含9种待测激素组分且基质组成与供试品相近的样品作为空白样品，取6 份，各0.2 g，精密称定，分别置10 mL 比色管中。分别加入上述系列标准溶液0.1 mL［13-14］，按供试品溶液制备方法制成氢化可的松、曲安奈德、氟轻松、曲安奈德醋酸酯、氟轻松醋酸酯、倍他米松戊酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松双丙酸酯、倍氯米松双丙酸酯质量浓度分别为2，5，20，40，100，200 ng/mL系列基质标准曲线溶液。

阴性样品溶液：取不含9 种待测激素组分的样品，按供试品溶液制备方法制备溶液，即得。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下混合对照品溶液和阴性样品溶液各适量，按2.1 项下色谱与质谱条件进样分析，记录多重反应监测色谱图。结果阴性样品溶液色谱中在对照品溶液色谱出峰时间处无相应吸收峰，提示其他成分对其测定无干扰。详见图1。

线性关系考察、定量限与检测限确定：取2.2项下系列基质标准曲线溶液，按2.1项下色谱与质谱条件进样测定，记录峰面积积分值，以各组分质量浓度（X，ng/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表3。取2.2 项下系列基质标准曲线溶液，逐级稀释，按2.1 项下色谱与质谱条件进样分析，当信噪比（S/N）为10∶1 时，得各化合物的定量限；当S/N为3∶1 时，得各化合物的检测限。结果见表3。

表3 9种糖皮质激素的线性关系考察结果、检测限与定量限、加样回收试验结果Tab.3 Results of the linear relation test，LOD，LOQ and the recovery test of nine glucocorticoids

精密度试验：取2.2 项下系列基质标准曲线溶液，按2.1 项下色谱与质谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果氢化可的松、曲安奈德、氟轻松、曲安奈德醋酸酯、氟轻松醋酸酯、倍他米松戊酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松双丙酸酯、倍氯米松双丙酸酯峰面积的RSD分别为3.13%，4.47%，4.07%，3.56%，4.24%，3.96%，3.05%，3.66%，3.61%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取2.2 项下阴性样品溶液6 份，分别精密加入等量2.2项下对照品贮备液，使各激素含量均为0.2 mg/g，按2.2 项下方法制备6 份供试品溶液，按2.1 项下色谱与质谱条件进样测定，记录6 份供试品溶液中9种激素含量。结果各激素含量的RSD均小于10%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验［15］：取重复性试验项下的供试品溶液1份，置室温下避光保存，分别于0，2，4，6，8，12 h时按2.1项下色谱与质谱条件进样测定，记录峰面积。结果各激素峰面积的RSD均小于8%（n=6），表明供试品溶液在室温下12 h内稳定性良好。

加样回收试验［15］：取2.2 项下混合对照品溶液，用乙腈稀释10倍，得质量浓度为5µg/mL的溶液；取阴性样品0.2 g，精密称定，共18 份，按低、中、高浓度水平分别加入上述混合对照品溶液10，80，400µL，平行3 份。按供试品溶液制备方法制备加标供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，计算含量和加样回收率。结果见表3。

2.4 样品含量测定

取8 批样品，依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱与质谱条件进样测定，采用外标法计算样品中各组分的含量。结果仅1 批样品检出氯倍他索丙酸酯，含量为8.35µg/g。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法优化

曾考察涡旋振摇和超声提取方法，以及不同提取时间（10，20，30，40 min），结果超声提取的回收率高于涡旋振摇提取，且超声提取30 min 的回收率趋于稳定。曾考察离心过滤和固相萃取2 种方法用于溶液净化，结果离心过滤的回收率高于固相萃取，且简便易行。

3.2 色谱条件优化

考察了C18柱（150 mm × 2.1 mm，3 µm）和C18柱（150 mm × 2.1 mm，5 µm）对测定结果的影响，结果3 µm 粒径C18柱的分离度和峰形均优于5 µm 粒径C18柱。流动相的有机相考察了乙腈和甲醇，乙腈的分离效果和洗脱能力均优于甲醇，水相考察了水、0.1%甲酸水溶液和0.1%乙酸水溶液，0.1%甲酸水溶液的色谱峰强度高于水和0.1%乙酸水溶液。采用梯度洗脱有助于化合物的快速洗脱，减少色谱峰的拖尾现象，且在流动相中加入少量乙酸有利于化合物的离子化，可提高灵敏度。