高通量技术筛选的米托蒽醌促进肝癌HepG2细胞凋亡的作用及机制

晏毛毛，刘宇华，蔡珊珊，何星星，谢步善

(南昌大学第一附属医院消化内科，南昌 330006)

原发性肝癌在我国是一类典型恶性肿瘤，其具体机制依旧不够清晰，且其发病率高，治疗效果不佳。肝癌的治疗方案，当前借助的是个体化综合治疗，然而患者5年生存率仍然极低[1]。随着我国临床药理学的飞速发展，开发肝癌新型抗肿瘤药已越来越受到人们的重视。高通量筛选技术(high throughout screening，HTS)是新型特异性抗肿瘤药物筛选的新策略和手段。

笔者前期研究[2]利用3个数据库(Tocriscreen、Prestwick、Selleck Chem)，共有3272个小分子化合物(参选的化合物其生物和药理特性、安全性和有效性在临床前期试验和临床试验中，获得了对应的验证)，将肝癌2种细胞株(HepG2和Huh7)添加到384孔的筛选化合物板，进而利用激光扫描成像仪(acumen®Cellista Laser Scanning Imaging Cytometer)(全孔药物筛选和细胞生物学高内涵分析平台)对上述小分子化合物进行了初步筛选，其中对于2种细胞系生长，起到同时抑制的效果，且z-score<-4的7类hits化合物中，包括常用的抗肿瘤药物盐酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride,MTX)。然而，MTX对肝癌细胞增殖抑制的作用机制仍然不清楚。本研究拟探讨不同浓度MTX对肝癌细胞凋亡的促进作用并初步探索其分子机制，为临床MTX治疗肝癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

肝癌HepG2细胞(北京大学医学部基础医学院生物化学和分子生物学系馈赠)；Caspase-3 antibody购自美国CST公司；BCA试剂盒及化学发光试剂购自美国PIERCE公司，N1,N2亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺购自美国sigma公司；DMEM购自美国Gibco公司；DMSO购自美国Sigma公司；其他为国产分析纯试剂。

1.2 细胞培养

迅速取出HepG2细胞冻存管，轻轻摇晃，于37 ℃水浴锅，进行细胞融化；将细胞悬液以800 r·min-1离心5～10 min，弃去上清液；添加1mLDMEM培养基，其包含10%血清，反复吹打重悬细胞，转移到细胞培养皿，放置于培养箱。等到细胞到达对数期时，弃去培养基，用PBS洗涤1次。加入一定体积的0.25%胰酶于常温进行消化，借助移液管对细胞进行吹打，根据特定比例进行传代培养，添加DMEM培养基(包含血清)。置培养箱中进行培养，展开相关实验。

1.3 MTT试验

将细胞接种在96孔培养板(104个·孔-1)，每孔培养基总量200 μL，于培养箱(37 ℃、5%CO2)进行为期24 h的培养；将不同浓度的MTX(0、0.5、1、2.5、5、10、20 μmol·L-1)处理肝癌HepG2细胞，作用24 h，添加MTT液，浓度为2 mg·mL-1，50 μL·孔-1，培养3 h。吸出孔内培养液，添加DMSO液(100 μL·孔-1)，将培养板置于微孔板扳荡器上振荡，10 min，使结晶物溶解。于570 nm处，针对各孔OD值，进行酶标仪检测。将结果记录下来，得到标准曲线图。

1.4 流式细胞术检测

HepG2细胞[(5×105)～(1×106)个·mL-1]铺入6孔板，于培养箱(37 ℃、5%CO2)培养24 h；20 μmol·L-1MTX处理肝癌HepG2细胞，作用24 h；取出1 mL细胞悬液，1000 r·min-1离心10 min，温度控制在4 ℃，将上清液弃去。添加冷的PBS 1 mL，轻轻震荡，使得细胞处于悬浮状态，1000 r·min-1离心10 min，温度控制在4 ℃，将上清液弃去。针对贴壁细胞，借助胰酶完成消化过程，进而借助PBS进行洗涤。于Binding Buffer(200 μL)中，进行细胞重悬过程。添加Annexin V-FITC，体积为10 μL，混匀，在避光室温条件，进行30 min的反应。添加Binding Buffer，体积为300 μL，进而添加5 μL PI，上机进行检测。

1.5 免疫印迹检测

HepG2细胞[(5×105)～(1×106)个·mL-1]铺入6孔板，于培养箱(37 ℃、5%CO2)培养24 h；5、10、20 μmol·L-1MTX处理肝癌HepG2细胞，作用24 h，RIPA Lysis Buffer裂解相应处理肝癌细胞后，用95 ℃煮沸，时长5～10 min变性蛋白，采用BCA试剂盒，针对蛋白浓度进行相应的测定。将15%和10% SDS-PAGE转移至PDVF膜，借助脱脂牛奶，进行1 h的常温封闭，孵一抗，在4 ℃条件下封闭过夜；辣根过氧化酶标记的二抗常温封闭2 h，针对特异蛋白条带，借助化学发光剂进行相应的检测。借助Image Lab软件，展开灰度分析过程，得到具体数值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 MTX抑制肝癌细胞增殖、提高cleaved Caspase-3表达水平

MTT试验检测结果显示，MTX抑制肝癌HepG2细胞增殖和生长，且呈浓度依赖性，其中5、10、20 μmol·L-1MTX处理的肝癌HepG2细胞增殖抑制率分别为0.69、0.67、0.43；与10 μmol·L-1MTX比较，20 μmol·L-1MTX的增殖抑制率显著下降(P<0.001)(图1A)。

细胞凋亡时Caspase家族是关键元件，前体Caspase-3(pro Caspase-3)经酶剪切后成为有活性的Caspase-3(cleaved Caspase-3)，Caspase-3在细胞凋亡调控中属于一类重要的效应分子，可作为细胞凋亡的标记分子。免疫印迹检测结果显示，5、10 μmol·L-1MTX作用肝癌细胞时cleaved Caspase-3轻度升高，其相应灰度值为2.25和2.37，而20 μmol·L-1MTX作用时cleaved Caspase-3显著增高，其灰度值为5.78(图1B)，与0 μmol·L-1MTX比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明MTX抑制肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡分子Caspase-3的表达，提示细胞凋亡的诱导可能与肝癌细胞增殖抑制相关。

A:MTT试验检测细胞增殖；B：免疫印迹检测检测cleaved Caspase-3表达水平。

2.2 MTX促进肝癌细胞凋亡

光学显微镜下观察显示，20 μmol·L-1MTX作用于HepG2细胞后，呈现出变圆、皱缩、脱落状态，飘浮在培养基中(图2A)，提示20 μmol·L-1MTX诱导肝癌HepG2凋亡。Annexin V FITC/PI流式细胞术检测结果显示，20 μmol·L-1MTX诱导的细胞凋亡率为21.12%，0 μmol·L-1MTX细胞凋亡率为9.07%，二者相比差异有统计学意义(P<0.05)(图2B)，结果表明MTX诱导肝癌HepG2细胞凋亡产生。

A:光学显微镜下的细胞凋亡；B：AnnexinV-FITC/PI双荧光流式细胞术检测细胞凋亡。

3 讨论

当前，抗肿瘤药物的研究过程中，HTS的应用较为广泛。笔者前期研究[2]借助3个数据库进行小分子化合物的初筛过程，z-score小于-4的hits化合物7种，包括常用于血液系统肿瘤的药物米托蒽醌MTX，研究证实HTS可以快速获得有效的新型抗肿瘤药物，可为将来快速研发抗肝癌药物打下扎实的基础。

MTX是一种蒽醌抗肿瘤新药，且在临床上较为常用，对恶性淋巴瘤等具备一定程度的治疗效果。MTX作用机制为：DNA进行结合，在核酸合成过程中起到抑制效果，引发细胞死亡，为细胞周期非特异性药物。本研究发现不同浓度的MTX会抑制肝癌细胞的增殖，其中高浓度(20 μmol·L-1)较为显著。细胞死亡被分为3类，即细胞凋亡、坏死及自噬性死亡。第3类定义为Ⅱ型程序性细胞死亡，区别于细胞凋亡[3]。本研究显示高浓度MTX可以诱导肝癌细胞凋亡，其抗肝癌作用与其相关。笔者观察到不同浓度MTX对肝癌细胞生长增殖的作用机制不尽相同，低浓度米托蒽醌主要促进自噬死亡从而产生抗肿瘤作用，高浓度的米托蒽醌却以促进细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用。笔者前期研究[4]显示，低浓度如5 μmol·L-1MTX细胞凋亡较少出现，主要以诱导自噬性死亡为主，而10 μmol·L-1MTX的抗肿瘤机制与前者相似；而浓度高达20 μmol·L-1时，米托蒽醌则会诱导细胞凋亡出现。细胞凋亡并非被动过程，该过程包括了基因调控过程，其目的是为了对环境有更好的适应性。既往笔者研究[5]苦参碱抗肝癌的作用机制得到类似结果，研究发现低剂量苦参碱诱导肝癌HepG2和SMMC-7721细胞系自噬性死亡，几乎凋亡无诱导；高剂量苦参碱诱导自噬性死亡和凋亡同时出现，以凋亡为主。自噬性死亡可以通过相应调控机制转化为细胞凋亡。低浓度的MTX通过自噬性死亡发挥抗肿瘤作用，可呈现，或者不呈现凋亡标志。于特定状况下，于自噬和凋亡两者当中，细胞会选取出相应的死亡途径。

细胞凋亡的过程涉及了Caspase-3家族等。凋亡是不同死亡信号刺激后发生的一系列由细胞内源性基因、酶类和信号传导途径调控的过程，借助下游基因内源性基因可直接控制细胞凋亡；而细胞外部因素可间接影响细胞凋亡。米托蒽醌促进肝癌细胞凋亡的作用机制知之甚少。本研究利用免疫印迹法观察到用MTX处理肝癌细胞后会显著增加切割后的Caspase-3蛋白酶活性，并且该活性具有浓度依赖性，这表明MTX诱导Caspase-3蛋白酶依赖的肝癌细胞凋亡。笔者由此判断米托蒽醌作用肝癌细胞时，Caspase通过与特异的辅因子结合而激活，进而通过有序切割、激活效应，最终激活Caspase-3蛋白酶，且将其他蛋自酶作切割底物，使得细胞凋亡。笔者推测Caspase-3是一种效应分子，是级联反应的核心，在MTX诱导细胞凋亡中，也是较为关键的步骤。