脐带消毒方式对脐带血污染率和脐带血质量的影响研究

陈伟意 史聪颖 李佩瑶 马天宝 颜红金 韦燕 魏伟

长久以来，脐带血被认为是生物废物直接丢弃，随着科学研究的不断进步，自1988年法国开展了世界上首例同胞脐带血移植治疗范可尼贫血以后，人们才渐渐意识到脐带血的重要性。除了进行造血干细胞移植治疗血液类疾病，重建造血、免疫系统，脐带血也被广泛应用于遗传病、代谢病、免疫病及再生医学（尤其是神经系统损伤）的临床治疗和研究[1]。目前，全世界脐带血造血干细胞保存量已超过600 000份，临床应用量已超过30 000例[2]。 脐血中含有比骨髓中造血干细胞更丰富更原始的、具有扩增能力的造血干细胞,其优点是来源广泛、采集简单,目前是继骨髓和外周血后的第三大造血干细胞来源[3]。但脐带血采集难免会有微生物污染的风险，受污染的血液如果进入到患者体内将会产生严重的后果，因此微生物检测为阴性是脐带血造血干细胞符合临床应用标准的条件之一[4]。 在不同分娩方式里，顺产后采集的脐带血，其受污染的可能性是最高的[5-6]。因此，严格规范产后脐带血采集消毒操作方式，是降低脐带血采集时的微生物污染率的最重要一环。本研究利用单盲随机对照的方式研究脐带消毒方式对脐带血污染率和脐带血质量的影响，为降低脐带血污染率提供了一种新的、可行性强的临床脐带血采集方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年5—12月在广州市南方医科大学附属何贤纪念医院产科分娩的400例孕妇。采用单盲随机对照的方法，把纳入的孕妇随机分成试验组与对照组，各200例，纳入标准：（1）孕产妇年龄18～45岁；（2）签署脐带血自存知情同意书；（3）孕产妇的信息记录完整。排除标准：（1）产前经医生评估后不适合术中采集脐带血的高危孕产妇；（2）已知造成宫内感染的孕妇。剔除标准：（1）采集的脐血中有凝块或异物；（2）脐带血采集信息表填写不完整的脐带血；（3）穿刺2次及以上采集到的脐带血；（4）含有脐血的采血袋在检测前破裂或有脐血漏出；（5）实验室处理脐血过程中导致污染的脐血。该试验的实施已获医院伦理委员会同意。所有病例资料采集均获得孕妇同意，并签署试验知情同意书。记录整理产妇的年龄，分娩结局及新生儿体质量作为一般资料，两组产妇的年龄、分娩结局和新生儿体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。

表1 两组产妇及新生儿一般资料比较

1.2 方法

试验组：阴道分娩时，应先在采血台上铺一张无菌巾，将脐带放在无菌巾上，然后开始消毒采集脐带血。用含碘伏的纱布或有尾纱条，包裹消毒整条脐带1次，选择胎盘断端的脐带4～5 cm位置作为穿刺部位，对穿刺部位再消毒2次，由脐带胎盘断端向胎盘方向擦拭穿刺点，不能来回擦拭（图1）。

图1 深度脐带消毒方案步骤

对照组：使用常规消毒方案。阴道分娩时，使用75%的酒精棉球对脐带穿刺部位消毒1～2次，由脐带胎盘断端向胎盘方向擦拭穿刺点，不能来回擦拭。

脐带血采集操作参照《脐带血造血干细胞库技术规范》[7]。穿刺操作在已经消毒的穿刺部位上穿刺采集，选择脐静脉相对平直，充盈处作为穿刺点。用无菌纱布固定防滑脱，进行脐静脉穿刺时，采血针尖斜面向下或偏向侧面，如果脐静脉相对平直，见血后针头沿血管壁顺行1～2 cm。让脐带血通过重力作用流入一次性采血袋内，同时轻轻摇晃采血袋，以便血液与采血袋内的抗凝剂充分混匀。脐带血采集后，立即保存在0～4℃冰箱中，待广东省脐带血造血干细胞库（以下简称广东省脐血库）工作人员统一收集并装入血液运输箱中（温度保持在4～25℃），自脐带血采集后36 h内运输至广东省脐血库。广东省脐血库在采集后48 h内完成脐血的制备，通过程序降温至-80 ℃后放置于液氮中保存。

1.3 观察指标

1.3.1 单个核细胞计数 脐带血到达广东省脐血库后，每份脐带血由两人复核信息，热合去除采血针及多余管路后，血袋称重并计算脐带血量。每份脐带血编码其唯一的编号，然后对血袋表面进行消毒。脐带血取1 mL全血血样，在五分类血球计数仪（日本，Sysmex，XE-5000）机器下对有核细胞进行计数，测算总有核细胞数。脐带血经离心制备后，从浓缩后脐血样本抽取约0.1 mL加入RPMI-1640培养液制备成稀释约10倍的细胞悬液，充分混匀细胞悬液后取出200 μL于五分类血球计数仪下计算冻前有核细胞计数。

1.3.2 细菌污染阳性率 在万级无菌操作室内，脐带血单个核细胞制备完后，将脐血分离出脐血血浆联袋，抽取脐血血浆10 mL分别接种至需氧瓶和厌氧瓶，采用全自动细菌培养仪培养7 d，检测是否有细菌污染。

1.3.3 CD34+细胞含量及有核细胞活性分析 采用流式细胞术对制备后获得的单个核细胞进行测定。流式细胞仪（FACSCalibur，BD公司）检测已标记好的样本，根据ISHAGE标准[7]，利用白细胞共同抗原-45（CD45）、白细胞共同抗原-34（CD34）单克隆抗体（CD45是有核细胞的特异性标志物，CD34是造血干祖细胞的特异性标志物）来对脐带血进行检测。根据造血干/祖细胞的4个特征[CD34阳性、CD45弱阳性、低前行散射光（SSC）、侧向散射光（FSC）]圈选出造血干/祖细胞占有核细胞的含量，即得到CD34+细胞含量。根据细胞染色剂7-氨基放线菌素D（7-AAD）可使死细胞染色的原理来检测脐带血中活细胞占有核细胞的含量，即有核细胞活性。

1.3.4 CFU-GM集落细胞培养分析 脐带血样本抽取约0.1 mL加入RPMI-1640培养液制备成稀释约10倍的细胞悬液，根据标本细胞悬液浓度及最终培养体系为3.3 mL，结合计算所需加入的甲基纤维素培养基及细胞悬液的各自体积，制成有核细胞终浓度定量为5×104个/mL的培养体系。将培养板放入37℃、5%CO2、湿度＞95%的CO2培养箱中培养14 d。培养结束取出培养板在倒置显微镜下观察，统计每份脐带血培养的3个孔的集落数，取其均值作为该份脐带血的粒细胞及巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）的计数结果。＞40个细胞组成的细胞团确认为1个集落，只计CFU-GM、粒细胞巨噬细胞系集落生成单位（CFU-GEMM）、单核系集落形成单位（CFU-M）集落，不计红细胞爆式集落形成单位（BFU-E）集落。

1.4 统计学处理

统计的数据分组在进行数据分析前未对数据分析处理人员揭盲，数据分析完成后由项目负责人对数据分组进行揭盲。数据分析采用统计软件SPSS 18.0处理。计量数据的检测结果以（±s）表示，两组间比较行独立样本t检验。计数资料以例数（n）和百分率（%）表示，予以χ2检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

试验组脐带血细菌污染率为1.0%（2/200），低于对照组的脐带血细菌污染率2.5%（5/200）。试验组与对照组的脐带血冻前有核细胞计数、CD34+细胞含量、冻前有核细胞活性和CFUGM细胞计数等比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 两组对脐带血质量的影响指标对比（ x- ±s）

3 讨论

脐带血造血干细胞在临床中主要用于治疗血液病及血液肿瘤等[8]，现也已有开展多项治疗神经系统损伤疾病的临床试验，如脑瘫、自闭症等[9-11]。脐带血的临床应用都需要把脐带血造血干细胞输注到患者血液中，一旦病原生物通过污染的血液入侵人体，会导致一系列不良反应，严重者甚至会危及患者性命。 鉴于血液细菌污染的严重性，所有入库的脐带血都必须检测为无菌的。脐血污染途径存在3种可能：（1）产房采集过程中污染；（2）运输途径中污染；（3）实验室处理过程中污染[6]。分离和采集是造成污染的主要因素，脐带血细菌污染90%以上是由采集环节造成的[4]，因此脐带消毒的方式对脐带血采集的污染率至关重要。

本研究试验组采用了含碘伏的纱布或有尾纱条作为消毒工具，相比于常规脐带消毒的用酒精棉球，可以更好地对脐带进行包裹，并可以全面地包裹抹擦脐带已达到更为深度的消毒效果。对采集脐带血的消毒步骤提出了质量可控的标准化操作流程：包裹消毒整条脐带1次，选择胎盘断端的脐带4～5 cm位置作为穿刺部位，对穿刺部位再消毒2次，可以进一步可控地防治脐血污染的发生，断绝污染途径。目前国内外并未有对脐带血消毒方式是否会对脐带血的污染率及脐带血质量产生影响的研究，本研究填补了这一空白。研究纳入的两组产妇年龄、新生儿体质量的值没有显著差异，减少了其对脐带血冻前有核细胞计数、CD34+细胞含量及CFU-GM的偏倚。同时纳入的产妇阴道产及剖腹产的数量接近，也减少了不同分娩结局对脐带血污染率不同的偏倚。研究结果表明，试验组的污染率为1.0%，冻前有核细胞计数（7.43±4.13）×108个，冻前有核细胞活性（96.50±2.41）%，CD34+细胞含量（0.30±0.15）%，CFU-GM（102.07±36.89）/105个细胞数。对比对照组，试验组细菌/霉菌的污染率下降1.5%，而与对照组冻前有核细胞数、CD34+细胞含量、有核细胞活性及CFU-GM的数值没有显著性差异，表明试验组的消毒方式不会对脐带血质量造成影响。

本研究脐带血的制备与保存均由广东省脐血库进行，广东省脐血库拥有符合美国病理学家协会（CAP）室间质评标准的洁净度达标的制备车间，并取得AABB美国血库协会认证和ISO9001质量管理体系认证。脐带血采集采用的是三连袋，在脐带血制备过程中，脐带血不会与外界接触，脐血的制备与分离能保证无菌环境。移植前对脐带血的筛选，除了人类白细胞抗原（HLA）配型结果及血型以外，有核细胞数、CD34+细胞含量、有核细胞活性、细菌霉菌污染及CFU-GM集落计数都是评价脐带血质量的重要指标[12-14]。随着脐带血研究的不断深入，未来脐带血的应用数量及范围将逐步上升，在保证脐带血质量的同时降低脐带血污染阳性率是提高脐带血库存量的关键。

本研究就脐带消毒方式对脐带血污染率及脐带血质量的影响进行研究，以确保脐带血质量的前提下，降低细菌污染阳性率。虽然试验组细菌/霉菌的污染率仅下降1.5%，但对于全国脐血库年采血量上百万份的体量，污染率下降1.5%即可有效降低因污染而导致的人力物力成本损耗，对现实操作有重要意义。本研究存在研究样本量的局限性，后续可继续进行扩大样本量研究。

综上所述，试验组的深度消毒方式不会对脐带血的质量产生影响，但是可有效降低脐带血细菌污染率，值得脐带血采集领域的关注。