右美托咪定对人乳腺癌SKBR-3细胞株MAPK/JNK/Bcl-2信号通路及癌细胞转移、侵袭的影响

顾健坤 马伟斌 姚明 周超瑞 陈国慧

乳腺癌的不良预后主要归因于乳腺癌细胞的高度复发与转移，进行相关的机制研究对提高乳腺癌患者的生存率至关重要［1-2］。凋亡是程序性的细胞死亡，诱导凋亡已被评估为处置癌细胞最有前途的方法。Bcl-2家族成员主要位于线粒体膜上，并与线粒体膜电位损失和细胞色素c释放密切相关。促细胞分裂剂活化蛋白激酶（MAPK）的活化参与细胞凋亡［3］，主要通过ERK1/2（p44/p42）、c-Jun氨基末端激酶JNK（p46/p54）和p38激酶三种途径。ERK1/2（p44/p42）主要被有丝分裂刺激激活，导致细胞生长和存活的生长因子；JNK和p38被DNA损伤，氢激活过氧化物，细胞表面受体Fas，紫外线照射，热渗透休克，化学治疗药物诱导导致凋亡的细胞死亡［4-5］。右美托咪定是一种具有止痛、镇静和血液动力学作用的亲脂性α2肾上腺素能激动剂，已广泛用于减轻应激反应和全身性炎症、抗焦虑、维持心血管系统的正常功能［6］。研究表明，吗啡和丙泊酚等麻醉剂可能会影响恶性实体肿瘤的发生发展［7］。本研究主要探讨右美托咪定对人乳腺癌SKBR-3细胞株MAPK/JNK/Bcl-2信号通路及癌细胞转移、侵袭的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪 器 及 试 剂 RPMI-1640培 养 基（Gibco，Invitrogen，5412）、胎牛血清（Gibco，Invitrogen，6541）、TRIzol试剂（Gibco，Invitrogen，63654）、青霉素（碧云天生物技术有限公司，36541）、链霉素（碧云天生物技术有限公司，2651）、裂解缓冲液（碧云天生物技术研究所，P0013）、二甲基亚砜（碧云天生物技术有限公司，6325）、BCA蛋白质试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司，5489）、Biotek Elx-800读板仪（美国赛默飞世尔科技公司）、化学发光底物显影（Thermo Fisher，美国赛默飞世尔科技公司）、3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）试剂（Sigma Chemical Co，36541）、Giemsa溶液（sigma，62556）、SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（sigma，3246）、SDS-PAGE膜（sigma，45874）、抗MAPK、JNK、Bcl-2（1∶1,000；Cell Signaling Technology Inc，65478、58774、24785）、辣根过氧化物酶二抗的山羊抗兔IgG（1∶1,000；Santa Cruz Biotechnology，USA，36574）、Annexin V试剂盒（美国Becton Dickinson公司，21546）、BD FACS Aria II流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）、计算机辅助图像分析仪（Olympus Microimage™图像分析，美国Windows 4.0版软件）、PrimeScript RT试剂盒（TakaraBio，69584）、半干转移装置（伯乐公司Bio-Rad，中国上海）、Molecular Imager Chemidoc XRS System（伯乐公司Bio-Rad，中国上海）、iQTM Green Supermix iQ5实时检测系统（伯乐公司Bio-Rad Laboratories，美国）、聚偏二氟乙烯膜（密理博公司Millipore，69658）。

1.2 细胞培养及分组 （1）细胞培养：人乳腺癌SKBR-3细胞株细胞获自西安空军军医大学，在带湿度培养箱（37 ℃、5%CO2、2% O2、93%N2）和含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基中培养。（2）分组：①SKBR-3细胞组：细胞浓度为5×106/mL的乳腺癌SKBR-3细胞液在10%FBS的RPMI-1640培养基中培养；②顺铂组：乳腺癌SKBR-3细胞培养方法同前，在培养基中加入顺铂100.0 μg/mL［8］；③右美托咪定低、高剂量组：乳腺癌SKBR-3细胞培养方法同前，分别加入右美托咪定100.0 μg/mL、200.0 μg/mL［9］。以上各组每孔设6个平行样，培养72 h。

1.3 细胞增殖及克隆形成数目测定 （1）细胞活力测定：使用MTT测定法，将细胞接种在96孔聚苯乙烯培养板中，于37 ℃、5%（v/v）的CO2中温育24 h，然后从每个孔中除去100 μL培养基，并将100 μL不同浓度的ISO加入细胞中并温育24 h、48 h。再将溶解于磷酸盐缓冲盐水中的100 μL 0.5%（w/v）MTT加入每个孔中，并孵育4 h，之后向每个孔中加入100 μLDMSO。使用Biotek Elx-800酶标仪（中国Bio-Rad实验室有限公司）测量490 nm处的吸光度。细胞存活率=（实验组OD-空白组OD）/（实验组OD-SKBR-3细胞组OD）。（2）克隆形成数目测定：各组乳腺癌SKBR-3细胞培养结束后，将细胞接种在6孔板中，50/孔，37 ℃下孵育14天，PBS洗涤3次，Giemsa溶液染色细胞，从7个随机视野计算克隆形成数目。

1.4 细胞侵袭转移水平测定 伤口愈合测试细胞侵袭，将乳腺癌SKBR-3细胞分别接种在多孔板上，并在含有10%FBS的RPMI-1640培养基中培养，直至达到汇合为止，然后使用移液器吸头（100 μL）闭合伤口。在测试开始时和细胞迁移2 h、4 h、6 h后捕获图像，比较图像以量化细胞的迁移速率。

1.5 细胞凋亡水平测定 采用Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）双重染色。所有乳腺癌SKBR-3细胞使用Annexin V试剂盒进行染色，1 h内使用流式细胞仪分析细胞。早期凋亡细胞具有暴露的磷脂酰丝氨酸，但完整的细胞膜与膜联蛋白V-FITC结合，但排除了PI；凋亡晚期的细胞均用膜联蛋白V-FITC和PI标记，而坏死细胞仅用PI标记。

1.6 细胞MAPK、JNK、Bcl-2基因水平测定 使用TRIzol试剂从培养的细胞中分离出总RNA 0.5 μg。使用PrimeScript RT试剂盒，用1μg总RNA合成第一链cDNA。应用SYBR Green qPCR SuperMix-UDG试剂在实时定量PCR使用iQTM Green Supermix iQ5实时检测系统进行PCR。应用比较循环阈值（Ct）方法通过计算2-ΔΔCt来量化基因表达水平。引物由上海生工科技合成，序列如下：MAPK，正向：5′-CGTGAGTGCCGCCCCCGTGA-3′，反向：5′-GTGTGACCCTGCTGTGCGTGACT-3′；JNK，正向：5′-TGTGACTGTGTCGGCAGCCCGTGACG-3′，反向：5′-CGTACTGCACGAATTCGTACTG-3′；Bcl-2，正向：5′-CCGTACTGACGTCGGCACCGTGAACTG-3′，反向：5′-GTGTGACGGCGAAGTGAC-3′。

1.7 细胞MAPK、JNK、Bcl-2蛋白水平测定 将细胞用PBS（pH 7.4）洗涤2次，并在含有1%PMSF和20 mM NaF的裂解缓冲液中在冰上裂解10 min，然后将其转移至微量离心管中，将样品在4 ℃下以15,000 g离心10 min，之后将上清液转移至新试管中，使用BCA蛋白质试剂盒测定总蛋白浓度。将从细胞制备的匀浆用SDS样品缓冲液处理，并立即在95 ℃下加热10 min。蛋白质通过SDS-PAGE膜分离后，使用半干转移装置电转移至聚偏二氟乙烯膜上，在TBST（20 mM Tris，166 mM NaCl和0.05%Tween 20，pH 7.5）中的5%脱脂奶粉中封闭2 h，然后将膜在台式浓缩器中于室温下以70 r/min洗涤15 min，该程序重复3遍后，将一抗以建议稀释度在TBST缓冲液中于4 ℃过夜添加，之后在TBST中洗涤3次，再加入二抗并在25 ℃下孵育2 h。印迹再经TBST洗涤3次，用化学发光底物显影，并使用Molecular Imager Chemidoc XRS System曝光。

1.8 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组比较采用单方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组乳腺癌SKBR-3细胞的OD值、存活率比较 与SKBR-3细胞组比较，顺铂组、右美托咪定低/高剂量组的OD值、存活率均降低（P<0.05）；与顺铂组比较，右美托咪定低/高剂量组的OD值、存活率升高（P<0.05）；与右美托咪定低剂量组比较，右美托咪定高剂量组的OD值、存活率降低（P<0.05）。见表1和图1。

表1 各组乳腺癌SKBR-3细胞的OD值、存活率比较［n=6，（±s）］

表1 各组乳腺癌SKBR-3细胞的OD值、存活率比较［n=6，（±s）］

注：与SKBR-3细胞组比较，aP<0.05；与顺铂组比较，bP<0.05；与右美托咪定低剂量组比较，cP<0.05

组别 剂量 OD值 存活率（%）SKBR-3细胞组 0μg /mL 0.87±0.08 90.32±2.63顺铂组 100.0μg /mL 0.32±0.07a 35.63±3.41a右美托咪定低剂量组 100.0μg /mL 0.65±0.05ab 74.63±3.54ab右美托咪定高剂量组 200.0μg /mL 0.52±0.08abc 56.63±4.23abc

图1 各组乳腺癌SKBR-3细胞增殖水平比较（倒置显微镜×400）

2.2 各组乳腺癌SKBR-3细胞的克隆形成数目比较 与SKBR-3细胞组比较，顺铂组、右美托咪定低/高剂量组的克隆形成数目降低（P<0.05）；与顺铂组比较，右美托咪定低/高剂量组的克隆形成数目升高（P<0.05）；与右美托咪定低剂量组比较，右美托咪定高剂量组的克隆形成数目降低（P<0.05）。见表2和图2。

表2 子宫内实性肿块MRI表现

表2 各组乳腺癌SKBR-3细胞的克隆形成数目比较［n=6，（±s）］

表2 各组乳腺癌SKBR-3细胞的克隆形成数目比较［n=6，（±s）］

注：与SKBR-3细胞组比较，aP<0.05；与顺铂组比较，bP<0.05；与右美托咪定低剂量组比较，cP<0.05

组别 剂量 克隆形成数目（个）SKBR-3细胞组 0μg /mL 1,265.63±26.63顺铂组 100.0μg /mL 325.63±41.63a右美托咪定低剂量组 100.0μg /mL 741.63±26.36ab右美托咪定高剂量组 200.0μg /mL 541.36±23.69abc

图2 各组乳腺癌SKBR-3细胞的克隆形成数目比较（Giemsa溶液染色×400）

2.3 各组乳腺癌SKBR-3细胞的侵袭迁移能力比较 与SKBR-3细胞组比较，顺铂组、右美托咪定低/高剂量组侵袭距离降低（P<0.05）；与顺铂组比较，右美托咪定低/高剂量组侵袭距离升高（P<0.05）；与右美托咪定低剂量组比较，右美托咪定高剂量组侵袭距离降低（P<0.05）。见表3和图3。

图3 各组乳腺癌SKBR-3细胞的穿膜数目比较（0.1%结晶紫染色×100）

表3 各组乳腺癌SKBR-3细胞侵袭迁移能力的比较［n=6，（±s）］

表3 各组乳腺癌SKBR-3细胞侵袭迁移能力的比较［n=6，（±s）］

注：与SKBR-3细胞组比较，aP<0.05；与顺铂组比较，bP<0.05；与右美托咪定低剂量组比较，cP<0.05

组别 剂量 侵袭距离（um）SKBR-3细胞组 0μg /mL 396.63±33.84顺铂组 100.0μg /mL 90.19±26.48a右美托咪定低剂量组 100.0μg /mL 159.48±54.96ab右美托咪定高剂量组 200.0μg /mL 123.48±18.87abc

2.4 各组乳腺癌SKBR-3细胞凋亡率比较 与SKBR-3细胞组比较，顺铂组、右美托咪定低/高剂量组的凋亡率升高（P<0.05）；与顺铂组比较，右美托咪定低/高剂量组的凋亡率降低（P<0.05）；与右美托咪定低剂量组比较，右美托咪定高剂量组的凋亡率升高（P<0.05）。见表4和图4。

表4 各组乳腺癌SKBR-3细胞凋亡率比较［n=6，（±s）］

表4 各组乳腺癌SKBR-3细胞凋亡率比较［n=6，（±s）］

注：与SKBR-3细胞组比较，aP<0.05；与顺铂组比较，bP<0.05；与右美托咪定低剂量组比较，cP<0.05

组别 剂量 凋亡率（%）SKBR-3细胞组 0μg /mL 5.18±0.14顺铂组 100.0μg /mL 36.40±2.27a右美托咪定低剂量组 100.0μg /mL 19.00±2.24ab右美托咪定高剂量组 200.0μg /mL 46.50±2.14abc

图4 各组乳腺癌SKBR-3细胞凋亡率比较

2.5 各组乳腺癌SKBR-3细胞MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA的表达水平比较 与SKBR-3细胞组比较，顺铂组、右美托咪定低/高剂量组的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表达水平降低（P<0.05）；与顺铂组比较，右美托咪定低/高剂量组的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表达水平升高（P<0.05）；与右美托咪定低剂量组比较，右美托咪定高剂量组的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表达水平降低（P<0.05）。见表5。

表5 各组乳腺癌SKBR-3细胞的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表达水平比较［n=6，（±s）］

表5 各组乳腺癌SKBR-3细胞的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表达水平比较［n=6，（±s）］

注：与SKBR-3细胞组比较，aP<0.05；与顺铂组比较，bP<0.05；与右美托咪定低剂量组比较，cP<0.05

组别 剂量 MAPK JNK Bcl-2 SKBR-3细胞组 0μg /mL 5.78±0.18 5.36±0.29 6.21±0.20顺铂组 100.0μg /mL 1.45±0.21a 1.68±0.23a 2.12±0.23a右美托咪定低剂量组 100.0μg /mL 4.56±0.24ab 4.01±0.16ab 4.21±0.19ab右美托咪定高剂量组 200.0μg /mL 3.02±0.26abc 3.14±0.19abc 3.10±0.16abc

2.6 各组乳腺癌SKBR-3细胞MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表达水平比较 与SKBR-3细胞组比较，顺铂组、右美托咪定低/高剂量组的MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表达水平降低（P<0.05）；与顺铂组比较，右美托咪定低/高剂量组的MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表达水平升高（P<0.05）；与右美托咪定低剂量组比较，右美托咪定高剂量组的MAPK、JNK、Bcl-2 蛋白表达水平降低（P<0.05）。见表6和图5。

图5 各组乳腺癌SKBR-3细胞MAPK、JNK蛋白表达水平的比较（电泳图）

表6 各组乳腺癌SKBR-3细胞MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表达水平比较［n=6，（±s）］

表6 各组乳腺癌SKBR-3细胞MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表达水平比较［n=6，（±s）］

注：与SKBR-3细胞组比较，aP<0.05；与顺铂组比较，bP<0.05；与右美托咪定低剂量组比较，cP<0.05

组别 剂量 MAPK JNK Bcl-2 SKBR-3细胞组 0μg /mL 6.47±0.19 6.43±0.24 6.24±0.23顺铂组 100.0μg /mL 1.19±0.16a 2.50±0.26a 1.96±0.32a右美托咪定低剂量组 100.0μg /mL 3.48±0.19ab 5.12±0.26ab 5.14±0.23ab右美托咪定高剂量组 200.0μg /mL 1.99±0.19abc 3.15±0.45abc 2.54±0.24abc

3 讨论

乳腺癌是最常见的侵袭性肿瘤之一，是全世界女性癌症死亡的主要原因，每年有近23万例新病例和4万例乳腺癌死亡。 乳腺癌的早期检测、诊断方面虽取得了进步，但外科手术以及放化疗之后的复发率呈上升趋势。因此，寻求乳腺癌新的治疗药物具有重要意义。

吗啡、戊巴比妥、曲马多、舒芬太尼和右旋等麻醉剂常被用于癌症患者的手术中。研究表明，吗啡皮下注射对于终末呼吸困难的患者非常有效；右美托咪定是一种α2肾上腺素受体激动剂，可用于减轻重症监护病房患者的全身炎症和剧烈疼痛，改善机械通气围手术期患者的呼吸功能［10］；右美托咪定还具有辐射防护作用，可改善脑肿瘤的放射治疗效果，可通过促进肺细胞增殖对肺泡上皮细胞的细胞凋亡起保护作用，此外右美托咪定还能抑制小鼠乳腺肿瘤细胞的侵袭性增殖［11-12］。本研究结果显示，与SKBR-3细胞组比较，右美托咪定低/高剂量组的OD值、存活率、单克隆形成水平、侵袭距离降低，而凋亡水平升高，说明右美托咪定能够明显抑制SKBR-3细胞株增殖、转移、侵袭，促进其凋亡，右美托咪定的抗癌活性归因于细胞黏附、增殖、存活、侵袭和细胞外基质降解有关的信号通路的抑制［13］。与其他癌细胞不同，乳腺癌细胞SKBR-3不会通过间充质或类动蛋白运动的活跃机制侵入，而是通过形成肿瘤栓子侵入，在3-D培养中形成球体，球体中的SKBR-3细胞保留了E-钙黏着蛋白的细胞-细胞黏附力。研究表明，右美托咪定可明显抑制癌细胞E-钙黏着蛋白表达水平。

与SKBR-3细胞组比较，本研究顺铂组、右美托咪定低/高剂量组的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平降低；与顺铂组比较，右美托咪定低/高剂量组的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平升高；与右美托咪定低剂量组比较，右美托咪定高剂量组的MAPK、JNK、 Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平降低；说明右美托咪定能够明显抑制SKBR-3细胞MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平。MAPK涉及细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程，丝氨酸/苏氨酸激酶家族响应于不同的细胞外刺激介导细胞内信号转导。MAPK是癌细胞生存信号转导所必需，MAPK的抑制在角鲨烯、紫杉醇、索拉非尼、洛伐他汀、和紫杉醇等各种抗癌刺激中被证实，抑制MAPK信号可以增强顺铂诱导人类肝癌细胞凋亡的能力［14-15］。线粒体介导的凋亡途径是固有的凋亡途径，通过细胞色素C的释放和随后caspase-3的裂解，最终导致细胞凋亡。Bcl-2家族成员是线粒体释放细胞色素c的抑制调节剂，可以通过改变其构象在线粒体外膜上形成线粒体通透性过渡孔（mPTP），使细胞色素C从线粒体释放至细胞质［16］。细胞试验表明，丁酸可通过抑制人结肠癌RKO细胞中的JNK激酶途径诱导细胞凋亡，JNK抑制Bcl-2的表达可促进凋亡细胞中细胞色素c的释放和caspase-3的活化。主要归因于JNK通过Bcl-2的磷酸化来解离Bcl-2/Bax复合物，最终促进活性Bax从胞质向线粒体区室的转运并诱导凋亡［17-18］。

综上所述，右美托咪定能明显抑制SKBR-3乳腺癌细胞增殖、转移、侵袭，促进其凋亡，与剂量呈正性相关，作用机制与明显抑制SKBR-3细胞MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达进而抑制MAPK/JNK/Bcl-2信号通路的激活有关。