十一方药酒对急性软组织损伤大鼠的保护作用研究

张文涛，杨家焱，蒋钦虹，毛德文，刘舒凌，田 慧，马雯芳*

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

急性软组织损伤多由于各种撞击、挤压等原因对人体皮肤、韧带、关节囊、骨骼肌肉、椎间盘等组织造成皮下出血点、局部肿胀、淤血、疼痛、功能障碍等病理性损伤，严重影响患者的生活质量［1-3］。十一方药酒为广西中医药大学第一附属医院院内制剂，具有舒筋活络、消肿散瘀、接骨止痛的功效，临床上用于治疗开放性骨折、膝关节炎、慢性软组织损伤及改善微循环等，疗效显著［4-6］。本研究观察十一方药酒对急性软组织损伤大鼠的保护作用，旨为其进一步开发提供现代药理学研究基础。

1 实验材料

1.1 动物 SD 大鼠，雄性，体质量（200±20）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0004，由广西中医药大学动物实验中心SPF级大鼠房饲养，温度18～25 ℃，湿度40%～70%。

1.2 仪器 TGL-20M 医用离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SQP电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DW-8GL338 海尔超低温保温箱，Haier BIO-MEDICAL 公司；INFINITE M200PRO 连续波长酶标仪，TECAN 公司；Blue Pard生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 药品与试剂 十一方药酒由本课题组自制，批号：20200302，生药量为193 mg/ml；扶他林软膏（双氯芬酸二乙胺乳胶剂），北京洛华制药有限公司，批号：4B5U；IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2ELISA 试剂盒，江苏酶免实业有限公司，批号202105；SOD、MDA 试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20210520。

2 实验方法

2.1 急性软组织损伤模型建立 参考文献［7］方法，取50 只SD 雄性大鼠，先剃除大鼠右后肢大腿处的毛发，再用6%硫化钠溶液进一步清除残余毛发。造模前用游标卡尺测量各大鼠左右后肢大腿肌肉直径，然后随机选取8 只大鼠作为空白组不造模，其余大鼠用20%乌拉坦溶液腹腔注射麻醉。预先将30 cm 长的PVC 塑料管垂直固定于铁架台上，将麻醉后的大鼠右后肢弯曲平放固定于铁架台上，并处于塑料管的正下方，将200 g 的砝码从塑料管的顶部做自由落体运动，使其正好砸中大鼠右后肢大腿肌肉处，重复进行5次，造成大鼠急性软组织损伤。造模成功的标准：通过肉眼观察以及用手触摸，大鼠大腿皮下有明显的出血点、淤青及肿胀，但皮肤无出血破损，无关节脱位以及骨折等开放性损伤状况，且其他部位一切都正常。本次造模有2 只大鼠骨折淘汰，选取造模成功的40 只大鼠作为实验观察对象。

2.2 动物分组及给药 将造模成功的40 只大鼠随机分为模型组、阳性组及十一方药酒高、中、低剂量组，每组8只。给药前用游标卡尺测量各大鼠左右后肢大腿肌肉直径。各组大鼠在软组织损伤部位涂抹相应的药物，空白组涂抹生理盐水，模型组涂抹白酒基质，阳性组予扶他林软膏500 mg/kg，十一方药酒高、中、低剂量组分别给予十一方药酒965 mg/kg、483 mg/kg、241 mg/kg，给药体积均为5 ml/kg。十一方药酒组用1 ml 注射器准确吸取药酒均匀涂抹于大鼠大腿损伤处，再用棉签涂抹1～2 min 促进药物吸收。各组每天给药2次，连续给药3 d。

2.3 指标检测 末次给药后，于次日上午用游标卡尺测量各大鼠左右后肢大腿肌肉直径，计算肿胀度。肿胀度（cm）=右后肢肌肉直径-左后肢肌肉直径。麻醉大鼠，剪开大鼠右后肢大腿损伤部位的皮肤，分离皮下组织，剪取部分肌肉组织，用PBS 液漂洗掉肌肉组织上的血迹后，滤纸吸干水分，剪取0.2 g，用玻璃匀浆器在冰水浴中制备10%匀浆液，将制备好的匀浆液用离心机以3 000 r/min 离心10 min，取上清液，分别用ELISA 测定IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2因子水平，TBA法检测 MDA 含量，WST-1 法检测 SOD 活力；另取部分肌肉组织用10%多聚甲醛溶液固定，制作HE 染色切片进行软组织病理形态检查。

2.4 统计学分析 实验数据采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（）表示，两组间数据比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠造模后及给药后右后肢肿胀情况 见图1、图2。结果显示，除空白组外，其余各组大鼠在造模后，肉眼观察可见右后肢大腿皮下有明显的淤青及肿胀，但皮肤无破损及出血，无开放性骨折情况，说明软组织损伤模型建立成功。给药治疗后，模型组大鼠右后肢肿胀无明显改善；阳性组（扶他林）及十一方药酒高、中、低剂量组大鼠右后肢肿胀明显减轻。

图1 造模后各组大鼠右后肢肿胀情况

图2 给药后各组大鼠右后肢肿胀情况

3.2 十一方药酒对软组织损伤大鼠后肢肿胀度的影响 见表1。结果显示，各组大鼠在造模后平均肿胀度均显著升高，与空白组比较均有显著性差异（P＜0.01）。给药后，阳性组（扶他林）及十一方药酒高、中剂量组均能显著减轻大鼠后肢肿胀度，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05 或P＜0.01），十一方药酒低剂量组大鼠后肢肿胀度也有减轻趋势，但与模型组比较，无显著性差异（P＞0.05）。

表1 各组大鼠后肢肿胀度比较 （，n=8）

表1 各组大鼠后肢肿胀度比较 （，n=8）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组 别空白组模型组阳性组（扶他林）十一方药酒高剂量组十一方药酒中剂量组十一方药酒低剂量组剂量（mg/kg）— —500 965 483 241造模前（cm）0.002 5±0.005 0.002 5±0.005 0.006 3±0.007 0.003 4±0.007 0.003 8±0.011 0.001 3±0.004造模后（cm）0.002 6±0.005 0.241 3±0.174①0.252 5±0.141①0.227 5±0.073①0.228 8±0.109①0.240 0±0.198①给药后（cm）0.001 3±0.004 0.218 8±0.131①0.097 5±0.060③0.088 8±0.051③0.106 4±0.046②0.147 5±0.067

3.3 十一方药酒对炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平的影响 见表2。结果显示，与空白组比较，模型组大鼠组织匀浆液中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，阳性组及高、中剂量十一方药酒组能显著降低IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平（P＜0.01或P＜0.05）。

表2 各组炎症因子水平比较 （，n=8）

表2 各组炎症因子水平比较 （，n=8）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组 别空白组模型组阳性组（扶他林）十一方药酒高剂量组十一方药酒中剂量组十一方药酒低剂量组PGE2（ng/ml）1.49±0.06 1.74±0.11①1.50±0.07③1.61±0.10②1.62±0.17 1.63±0.17剂量（mg/kg）— —500 965 483 241 IL-1β（pg/ml）33.81±3.56 40.43±2.49①34.82±1.92③35.20±3.53③36.05±4.67②38.46±3.12 IL-6（pg/ml）132.84±10.15 155.62±16.44①134.91±14.24②136.04±15.19②138.89±12.20②141.70±14.69 TNF-α（pg/ml）333.70±12.11 397.44±37.33①336.89±22.57③346.20±27.86③347.42±38.94②350.15±39.74②

3.4 十一方药酒对软组织氧化指标MDA、SOD 的影响 见表3。结果显示，与空白组比较，模型组MDA水平显著升高，SOD 活性显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，阳性组及十一方药酒高、中剂量组均能显著降低MDA水平（P＜0.05）；阳性组及十一方药酒高、中、低剂量组能显著升高SOD活性（P＜0.05）。

表3 各组大鼠软组织MDA、SOD含量 （，n=8）

表3 各组大鼠软组织MDA、SOD含量 （，n=8）

注：与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

SOD（U/mg）16.36±1.45 12.58±4.05①17.63±4.59②17.12±1.38②17.41±1.35②16.69±3.50②组 别空白组模型组阳性组（扶他林）十一方药酒高剂量组十一方药酒中剂量组十一方药酒低剂量组剂量（mg/kg）— —500 965 483 241 MDA（nmol/mg）43.35±9.70 74.31±27.33①42.10±27.29②46.11±8.82②50.60±10.56②56.41±20.79

3.5 十一方药酒对大鼠软组织的影响 见图3。结果显示，空白组大鼠的肌肉组织内肌束大小不一，肌细胞细而长，呈纤维状或不规则状，排列紧密整齐，肌浆染色均匀，细胞核呈扁平或椭圆形、染色质少、核仁明显，未见明显变性或坏死。肌间可见血管、神经等分布，无明显炎细胞浸润及纤维组织增生，未见明显病理形态改变。与空白组比较，模型组肌束紊乱、肌纤维溶解、坏死、并有炎性因子浸润，组织损伤明显；与模型组比较，阳性组及十一方药酒组肌束稍紊乱、坏死明显减少，炎性因子减少，损伤程度明显降低。

图3 大鼠软组织HE染色切片（×200）

4 讨 论

当机体局部软组织受到损伤之后，会直接导致局部组织细胞变性坏死，毛细血管破裂、血管壁通透性增加等病理改变。同时，局部血液循环被破坏后，引起局部水肿，组织缺氧，进一步导致细胞坏死等，而炎症反应会贯穿软组织损伤与修复的整个过程，其中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2是炎症反应过程中重要的炎症细胞因子［8-9］。白介素是主要由多种免疫细胞经过刺激后所分泌的一种具有生物活性的细胞因子，其中IL-1β 和IL-6 是常见的促炎因子，在炎症和免疫性疾病中发挥重要作用。TNF-α 是由活化的巨噬细胞分泌的细胞因子，不仅参与炎症反应，同时能进一步刺激白介素等细胞因子的分泌，促进炎症反应进一步加深。PGE2是一类活性较强的炎症介质，同时也有致热与致痛作用，并与其他炎症介质产生协同作用加速炎症反应［10-11］。

机体组织在炎症反应和创伤应激期间，多形核白细胞等炎症细胞发生浸润，产生许多的自由基及代谢产物，且自由基清除酶活性下降，引起膜的脂质氧化应激反应，导致组织和细胞损伤进一步加剧，使受损组织愈合延缓。所以减少自由基的生成和释放将缓解炎症反应［12］。MDA 是自由基攻击脂质而引起过氧化的最终代谢产物，对组织细胞具有毒害作用，通过测定体内MDA的生成量，可间接地反映自由基的水平以及对组织细胞的损伤程度，是目前普遍公认能体现自由基产生和引发脂质过氧化反应的间接性指标［13］。SOD 是广泛存在于人体组织中的一种酶，具有强抗氧化性、消除体内自由基，保护正常细胞免受毒害，加快修复受损组织的能力，表现出超强的抗炎作用［14］。

本研究中大鼠急性软组织损伤模型的造模方法称为自由落体组织损伤法、机械冲击挫伤法，该方法属于非开放性软组织造模，引起肿胀淤血等软组织损伤病症，其体征和致病原因与临床上的软组织损伤相似，实验方法成熟可靠，且重复性较好［15］。本实验中使用重200 g的砝码，将其从高30 cm 处做自由落体砸伤大鼠右后肢大腿，造模后可以立刻看到大腿皮下有出血点以及肿胀，因肿痛而导致大鼠走路跛行，无骨折和皮肤破损出血，符合临床标准。

十一方药酒作为传统医院制剂，由重楼、自然铜、红花、没药、续断、虫等多味中药组成。本研究以软组织损伤大鼠为模型，观察其对软组织损伤的保护作用。实验结果表明，十一方药酒对急性软组织损伤大鼠有保护作用，其作用机制与降低炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平，降低氧化指标MDA 水平，提高SOD活力有关。