注射用头孢尼西钠残留溶剂质量分析

李佩 李雪 洪建文 田洁

(1 广东省药品检验所，广州 510663；2 国家药品监督管理局药品评价中心，北京 100022)

头孢尼西钠(cefonicid sodium)，为第二代广谱、长效的头孢类抗生素，通过抑制细菌细胞壁合成产生抗菌活性，对革兰阳性和阴性菌以及一些厌氧菌均有抗菌作用，对大多数β-内酰胺酶稳定。临床上适用于下列敏感菌引起的感染：下呼吸道感染、尿路感染、败血症、皮肤软组织感染、骨和关节感染，也可用于手术预防感染[1-2]。

本实验室承担了2019年注射用头孢尼西钠国家评价性抽验[3-4]，抽样共涉及13家生产企业80批次样品，通过对制剂的梳理，发现制剂质量受原料质量的影响较大，使用同一原料的不同制剂生产企业，其产品残留溶剂的种类和量呈现同一趋势，研究采用气相色谱的方法[5-6]对原料及制剂中的残留溶剂进行研究分析，提示企业应根据其生产工艺来建立个性化的质量控制要点，以保证产品的质量。

1 仪器与试药

气相色谱仪(Agilent 6890、Thermo Trace1300)，检测器(氢火焰离子化检测器)，色谱工作站(Empower、变色龙软件)，电子天平(Sartorius CP225D，十万分之一)，毛细管色谱柱(DB-1毛细管柱，30 m×0.53 mm，1.0 μm，SN：US4886831H、SUPELCO WAX-10毛细管柱，30 m×0.53 mm，1.0 μm，SN：64181-01A)，样品(2019年国家评价性抽验样品以及企业提供的6批原料样品)。

2 方法与结果

2.1 残留溶剂的种类和量

照《中国药典》2020年版二部头孢尼西钠残留溶剂检测方法对样品进行检测[7]，分析不同生产企业的注射用头孢尼西钠残留溶剂的差异。

2.1.1 色谱条件

以DB-1，30 m×0.53 mm，1.0 μm(SN：US4886831H)为色谱柱，程序升温，起始温度为45℃，保持5 min，再以10 ℃/min的速率升温至180℃；载气为氮气，流速为3 mL/min；FID进样口温度为150℃；检测器温度为200℃；顶空平衡温度为90℃，平衡时间为20 min。

2.1.2 溶液的制备及测定

对照品溶液精密称取甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃和二氯甲烷各适量，加水定量稀释制成每1 mL中分别含甲醇0.6 mg、乙醇1.0 mg、乙腈0.082 mg、丙酮1.0 mg、乙酸乙酯1.0 mg、四氢呋喃0.144 mg和二氯甲烷0.12 mg的溶液，精密量取5 mL，置顶空瓶中，密封。

供试品溶液精密称取样品1.0 g，置顶空瓶中，精密加水5 mL使溶解，密封。

将对照品溶液与供试品溶液，分别顶空进样，记录色谱图。

2.1.3 供试品中残留溶剂的检测结果

按“2.1.1”项下的色谱条件对国评抽样中的26批制剂以及企业提供的6批原料进行检测，检测出第二类溶剂甲醇和四氢呋喃，第三类溶剂乙醇和丙酮，未检出第一类溶剂乙腈和二氯甲烷。不同企业间甲醇和乙醇的残留水平较为接近，且均在限度范围内；丙酮的量厂家A、B、C高于其他厂家，其主要受原料来源的影响；四氢呋喃仅存在厂家D～M中，厂家A、B、C中不存在，主要也是受原料的影响。通过对不同制剂及原料残留溶剂的检测，发现制剂残留溶剂的种类和量主要受原料影响，两家原料企业均未检出第一类溶剂，第二类和第三类溶剂均在可控范围内，使用原料企业B的制剂在残留溶剂方面质量优于企业A。结果见表1～2和图1。

图1 残留溶剂典型色谱图Fig.1 Typical chromatogram of residual solvent

表1 供试品中残留溶剂测定结果Tab.1 The results of residual solvents in samples

2.1.4 需关注的溶剂

本次检测除药典规定的残留溶剂种类外，还发现3个溶剂峰。对3个溶剂进行研究，通过采用对照品定位、气相质谱联用等方法对溶剂进行定性。

溶剂峰1为异丙醇，属中国药典残留溶剂项下规定的第三类溶剂，应限制使用，推测原料合成工艺中使用了该溶剂，企业应对其进行控制，可采用中国药典现有残留溶剂方法进行检测控制。

溶剂峰2为异亚丙基丙酮，通过GC-MS联用技术，并使用异亚丙基丙酮对照品进行定性，其存在于原料企业B中，含量在0.001%～0.008%之间。典型色谱图见图2～3。

图2 异亚丙基丙酮对照品色谱图Fig.2 Chromatogram of isopropylidene acetone reference substance

由于在头孢尼西钠原料合成过程中未使用该物质，推测异亚丙基丙酮残留可能有以下两个原因：①原料合成过程中使用了回收再利用的丙酮，该丙酮中含有异亚丙基丙酮，从而导致其残留在原料中；②合成过程中使用的丙酮与起始物料反应产生了该物质。异亚丙基丙酮为不饱和酮具有遗传毒性致癌警示结构(QSAR评估——3类杂质：不饱和酮，含有与原料药有无关的警示结构，无致突变性数据)，企业应确保将该溶剂控制在安全阈值以下。

溶剂峰3为2-乙基己酸，原料合成过程中的成盐剂2-乙基己酸钠是头孢尼西酸的成盐过程中提供钠离子的载体，反应过程中2-乙基己酸钠转化成2-乙基己酸，2-乙基己酸是一种有害物质，对皮肤、黏膜有刺激作用[8]，因此需要对该溶剂的残留进行控制。

表2 原料中残留溶剂测定结果Tab.2 The results of residual solvents in API

2.2 2-乙基己酸检测方法的建立

为了更好地对2-乙基己酸的残留量进行控制，在《中国药典》2-乙基己酸的检测方法基础上，建立头孢尼西钠中2-乙基己酸检测方法，并进行了方法验证。

2.2.1 色谱条件

以SUPELCO WAX-10毛细管柱，30 m×0.53 mm，1.0 μm(SN:64181-01A)为色谱柱，载气为氮气，流速为7.0 mL/min，检测器为FID，检测器温度为300℃，柱温为150℃，进样口温度为200℃，进样体积为1 μL。

2.2.2 溶液的制备及测定

盐酸溶液：量取33 mL浓盐酸，置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，即得。

图3 供试品典型色谱图Fig.3 Typical chromatogram of sample

内标溶液：精密称取3-环己丙酸约250 mg，置250 mL量瓶中，用环己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液：精密称取2-乙基己酸对照品75 mg，置50 mL量瓶中，用内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取l mL，置离心管中，加33%盐酸溶液4.0 mL，剧烈振摇1 min，离心，取上层清液。

供试品溶液：精密称取供试品约0.3 g，置离心管中，加33%盐酸溶液4.0 mL使溶解，精密加入内标溶液l mL，剧烈振摇1 min，离心，取上层清液。

将对照品溶液与供试品溶液，精密量取1.0 μL，分别进样，记录色谱图。

2.2.3 线性关系考察

精密称取2-乙基己酸对照品适量，制成不同浓度的标准溶液，按“2.2.1”色谱条件分别进样，记录峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明2-乙基己酸在浓度0.0501～2.5050 mg/mL范围内线性关系良好，回归方程y=0.9401x+0.0039，相关系数r=0.9997。

2.2.4 准确度试验

内标溶液：精密称取3-环己丙酸约250 mg，置250 mL量瓶中，用环己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品储备液制备：精密称取2-乙基己酸75 mg，置25 mL量瓶中，加内标溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液1、2、3：分别精密量取对照品储备液2、2.5和3 mL，分别置5 mL量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

取注射用头孢尼西钠(批号：068180301)约0.3 g，精密称定，称取9份，分别置10 mL离心管中，将9份溶液分别加入33%盐酸溶液4 mL，精密加入对照品溶液1、2、3各l mL，剧烈振摇1 min，离心，取上层清液，测定2-乙基己酸的量。结果见表3。

表3 2-乙基己酸准确度测定结果Tab.3 The accuracy results of 2-ethylhexanoic acid

2.2.5 重复性试验

照“2.2.2”项下方法配制成供试品溶液6份进行测定。结果表明，6份供试品中2-乙基己酸含量的RSD为1.6%，符合要求。重复性结果见表4。

表4 重复性实验结果Tab.4 The results of repeatability

2.2.6 检出限和定量限试验

精密称取2-乙基己酸对照品，用内标溶液逐级稀释，取各浓度试验用溶液依次注入气相色谱仪进行分析。调节仪器灵敏度，以信噪比3为检出限，最低检出浓度为2.4 μg/mL；信噪比10为定量限，最低定量浓度为4.8 μg/mL。

2.2.7 耐用性试验

按照“2.2.1”色谱条件，分别调节流速为5 mL/min、9 mL/min以及柱温为140℃、160℃，其他色谱条件保持不变，进行试验，考察2-乙基己酸以及3-环己丙酸的出峰时间、分离度及理论塔板数，结果表明不同条件下分离度及理论板数均符合要求，说明该方法耐用性良好。耐用性试验检测结果见表5。

表5 耐用性试验检测结果Tab.5 The results of durability

2.2.8 供试品中2-乙基己酸的检测结果

本次验证中10家生产企业生产的63批次供试品，均采用上述方法进行检测，结果均在限度(0.3%)范围内，且批间稳定性较好。检测结果见表6。

表6 供试品中2-乙基己酸的检测结果Tab.6 The test results of 2-ethylhexanoic acid in samples

3 结论

按《中国药典》2020年版头孢尼西钠残留溶剂方法检测，国内产品残留溶剂控制得比较好，未检出一类溶剂，其他残留溶剂的量也控制在较低水平。

本次残留溶剂检测中发现3个需要关注的溶剂，现有标准未控制，但产品中实际存在，其中2个有一定的毒性，分别为2-乙基己酸和异亚丙基丙酮，需要关注和控制，研究建立了2-乙基己酸的检测方法对其进行控制。

通过对注射用头孢尼西钠残留溶剂的质量分析，进一步显示残留溶剂与原料合成工艺密切相关，也揭示工艺的变化和稳定性，作为药品安全性指标，《中国药典》2020年版中对残留溶剂控制的要求指出，企业应根据生产工艺的特点，制定相应的限度，使其符合产品规范、药品生产质量管理规范(GMP)或其他基本的质量要求，因此需要企业根据自身产品情况制定方法和限度要求，以保证药品的安全和质量。