乙型肝炎病毒X基因及其变异促肝细胞癌的作用机制

周鑫宇 柳东红 蔡仕良 陈宏森 何奕达 王瑞华 曹广文

据全球癌症统计数据，2020年原发性肝癌发病人数居所有癌症第六位，而死亡人数居所有癌症第三位；且在全球范围内，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌的主要类型，占 75%～85%［1-2］。在我国，原发性肝癌位于非成熟死亡（平均寿命之前的死亡）原因第一位，其中HCC占94.6%，且我国的HCC主要由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染引起（占87.5%）［3-5］。尽管随着HBV疫苗的普及以及对携带者进行积极的抗病毒治疗，HBV感染所致的HCC造成的负担已逐渐减轻［6-8］，但治疗乙型肝炎仍然是我国HCC初级预防的关键战略。

HBV致癌依赖三大因素：病毒复制、整合和进化，其中HBV X基因（HBV X gene，HBx）在这个过程中起主要作用。HBx通过促进共价闭合环状DNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）结合的组蛋白乙酰化和病毒限制因子泛素化等机制促进HBV复制。HBx还是HBV整合到宿主基因组的最主要区域，并导致有促癌能力的C-端截短型HBx（c-terminal truncated HBx，Ct-HBx）和融合转录本形成。同时，HBx也是HBV进化的主要区域，免疫微环境和遗传选择下的HBx变异具有更强的致癌能力。此外，HBx及其变异可以调控关键基因的表达，影响相关信号通路激活，从而发挥原癌基因作用，进而参与HCC发生发展中的多种生物学过程［9］。因此，研究HBx及其变异在HBV相关HCC（HBV-HCC）发生发展以及防治等方面的作用有重要意义。本文就HBx及其变异在HCC中的致癌作用及其机制进行综述。

1 HBx调控HBV复制

HBV是一种部分双链的环状DNA病毒，约3.2 kb。HBV病毒具有4个开放阅读框，分别是S区、C区、P区以及X区，编码7种蛋白质（preS1、preS2、S、preC、C、病毒聚合酶、HBx蛋白）和4个调控元件（增强子Ⅱ/基础核心启动子、preS1启动子、preS2/S启动子和增强子Ⅰ/X启动子）。HBx基因全长为779 bp（nt.1060～1838），其中nt.1060～1373段为HBx的启动子区，nt.1374～1838为HBx的编码区；而HBx的编码区是HBV基因组最小的开放阅读框，编码154个氨基酸，蛋白大小为17 kDa；因HBx蛋白与目前已知的蛋白均不具有同源性，故而得名［9］。HBx促癌机制见图1。

图1 HBx促癌机制示意图Fig.1 Schematic diagram of HBx promoting cancer mechanism

HBV的复制可导致持续的慢性炎症，这也是导致肝硬化和HCC发生的关键因素，高病毒载量还与不良预后相关［10］。在HBV的生命周期中，HBx是HBV cccDNA转录和病毒复制的调控蛋白。HBx通过参与多种表观遗传修饰如甲基化、乙酰化、泛素化和非编码RNA的表达来影响cccDNA的表达和HBV复制［11］。

乙酰转移酶和去乙酰转移酶通过调控cccDNA结合的组蛋白状态，对cccDNA发挥翻译后修饰功能，从而影响HBV复制。HBx在促进cccDNA结合的组蛋白乙酰化的同时也防止其去乙酰化，从而产生更多的前基因组RNA，并增加HBV循环［12］。HBx还可使关键分子泛素化，干扰天然免疫反应对HBV的攻击，从而实现免疫逃逸并维持HBV稳定复制。DNA损伤特异性结合蛋白1（damage-specific DNA binding protein 1，DDB1）是病毒复制必须的，HBx与DDB1的相互作用还可使HBV限制因子WDR77、SMC5/6和SETDB1等泛素化和降解，从而促进cccDNA转录和HBV复制［13］。miRNA可以调控HBV复制，同时也能被HBV复制所调控，其中HBx起主要调控作用。HBx引起的miR-122下调还会增强HBV的复制能力，同时诱导病毒持续性感染［11］。

2 HBx是HBV整合的高频区域

HBV整合到宿主基因组是HCC发生的分子机制之一，高通量测序表明，在76.9%的HBV-HCC患者中，HBV基因组会整合到宿主基因中［14］。虽然HBV是随机整合到宿主基因组中，但是病毒基因组内nt.1600～nt.1900之间的区域（对应HBx区的3'端和前核心区的5'端）是发生整合最常见的区域［15］。

2.1 Ct-HBx具有更强的促癌能力

HBx区的3'端整合到宿主基因组导致Ct-HBx产生，且Ct-HBx与不良预后相关［16］。目前，各种不同的Ct-HBx已在HBV感染以及相应的肝硬化和HCC患者中被发现。Ct-HBx较全长HBx有更强的促癌作用，其中与HCC发生发展关系密切的Ct-HBx包括HBx-△127、HBx-△130、HBx-△124、HBx-△140、HBx-△119、HBx-△120、HBx-△134等［17］。其中研究最多的是HBx-△127，其可促进正常肝细胞中NF-κB、生存素和人类端粒酶逆转录酶活性，以及促进c-Myc和增殖细胞核抗原表达水平，还能通过5-LOX上调SREBP1c表达增加FAS的转录，从而促进肝癌细胞生长［18］。HBx-△120或HBx-△134可与NFATC2协同作用下调TXNIP表达，从而导致糖代谢重编程，进而启动HCC的发生并促进癌细胞迁移和侵袭［19］。HBx-△130或HBx-△119可以激活 caveolin-1/LRP6/β-catenin/FRMD5轴，从而促进HCC发生及侵袭、转移［20］。

2.2 HBx导致宿主基因组整合突变

HBV整合到宿主基因组上，从而干扰宿主基因组稳定性。HBx整合到TERT、MLL4和FN1等癌症相关基因的调控区域并影响其表达［15］。HBV整合容易产生HBV-宿主嵌合转录本，发挥致癌作用。HBV-宿主嵌合转录本主要是HBx基因与人类基因内含子内重复元件的融合［21］。HBx-LINE1嵌合转录本作为一种长链非编码RNA，可下调miR-122表达水平，导致WNT/β-catenin通路活性增加，并诱导集落形成以及细胞侵袭和迁移，最后导致肿瘤发生发展［22］。

3 HBV进化产生更强致癌能力的HBx变异

在慢性乙型肝炎进展到HCC的过程中，HBV进化是最突出的分子事件［23-24］。HBV的进化遵循达尔文模型：突变-选择-适应。在HBV病毒复制过程中因缺乏校对功能而容易发生基因突变，而慢性炎症环境使突变率增加［23，25］。大多数HBV突变体被抗病毒免疫反应消除，只有小部分利于病毒复制生存且促进肝细胞再生的突变HBV能够存活，并逐渐发展成促HCC克隆［26］。HBx是HBV发生突变的高频区域，在人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptides，APOBECs）、遗传易感性、免疫微环境和抗病毒治疗等作用下，HBx变异发生累积，而具有强烈致癌作用的突变型HBx被选择，从而可以预测HCC的发生与复发。

3.1 HBx变异的产生与APOBECs

使HCC发生风险增加的HBV突变主要位于增强子Ⅱ/基础核心启动子区/前核心（EnhⅡ/BCP/PC）以及preS区域［27］。其中增强子Ⅱ（nt.1636～1744）和基础核心启动子区（nt.1751～1769）与HBx开放阅读框（nt.1060～1838）重叠。其中，APOBECs诱导的突变是HBV变异的来源［28］。APOBEC3s的表达水平与HBV准种复杂性呈正相关［29］。衰老、环境暴露和遗传易感性有助于激活和维持非溶解性炎症，活化的炎症信号通路可以反式激活APOBECs表达，从而促进HBV和体细胞突变。IL-6诱导的APOBEC3B-UNG失衡的遗传多态性能显著促进HCC-HBV突变的产生［30］。EnhⅡ/BCP/PC区对APOBEC3成员的编辑非常敏感，编码HBx的序列尤其容易被编辑。APOBEC3更倾向于将HBx区域作为其编辑靶点，并产生Ct-HBx等突变型［31］。

3.2 HBx突变在HCC发生发展过程中逐渐累积

目前在病例对照研究和队列研究中均发现位于HBx基因区的几个关键突变（G1613A、C1653T、T1674C/G、T1753V、A1762T/G1764A）是HCC发生的风 险 指 标［32-33］，突 变 组 合（C1653T、T1753V 和A1762T/G1764A）还可有效预测HCC的发生［34］。在一项包含43项研究的荟萃分析中发现，C1653T、T1753V以及A1762T/G1764A双突变均与HCC发生风险有关，且这些突变在乙型肝炎感染者从无症状携带发展为HCC过程中是逐渐累积的，同时无论是存在单独位点还是这些位点的组合突变都具有HCC发生风险［35］。以上流行病学研究表明，在慢性肝炎所致的肝硬化向HCC进展过程中，HBx突变的种类和频率逐步累积，且HBx突变的累积是HCC发生的高危因素，HBx突变组合可用于预测HCC的发生和发展。

3.3 HBx突变与遗传及免疫环境相互作用

HBx突变的选择是由遗传及免疫微环境共同决定的，与欧洲人群相比，我国人群的常见基因型与HBV慢性感染风险增加以及HBx突变的免疫选择显著相关［26］。在我国人群中，STAT3基因的rs2293152少见基因型显著促进HBx突变A1762T/G1764A和T1674C/G的选择，并且与HBx突变存在显著的交互作用，协同促进HCC发生［36］。NF-κB1与其抑制分子NFKBIA启动子遗传多态性是HBV C型感染者发生HCC的危险因素，NFKBIA启动子SNP，rs2233406和rs3138053的少见基因型（rs2233406T、rs3138053G）通过降低NFKBIA表达，增加NF-κB1活性，促进炎症对A1762T/G1764A、T1753V等促癌HBx突变的选择［37］。rs28362491的变异基因型（缺失型）与HBV C型感染者中A1762T/G1764A频率增加显著相关；rs2233406少见基因型还与A1762T/G1764A交互作用而显著增加HCC发生风险［37］。HLA-DP的遗传多态性（rs3077、rs3135021、rs9277535）与HBV炎症慢性化密切相关，促进 HBV 清 除 的 基 因 型（rs3077T、rs3135021A、rs9277535A）与HBx促癌突变（C1653T、T1674C/G等）呈负相关，而与抑癌HBx突变（G1652A、T1673C、T1674C、G1719T、G1730C、G1799C 和A1727T）呈正相关［38］。我国HLA-DR SNPs少见基因型（rs3135395T、rs3135338C和rs477515T）可显著降低HBV持续存在和HCC发生风险，且HLA-DR少见基因型与HBx区突变（A1762T/G1764A、T1753V和C1653T）的产生呈负相关［39］。还有研究显示，HLA-DP、HLA-DR和HLA-DQ的遗传多态性均与HBx突变在乙型肝炎导致的HCC中存在显著的交互作用［40］。

3.4 HBx突变与抗病毒治疗药物

高病毒载量与HBV-HCC患者术后不良预后相关，抗病毒治疗可以显著降低HCC复发及其相关死亡风险［41-42］，但对Ct-HBx的促癌能力没有影响［43］。长期治疗期间，核苷类似物的疗效会因耐药突变体的出现而降低。研究发现在耐药患者中HBx的L30V、P31S、L34F、P39S、A40P、P42S、P43S、T47A、G87Q/R、N88V、T118K、E119D、V127I、K130M、V131I等15个氨基酸残基出现了较高的突变频率，还存在多个位点的缺失/截断和插入，且这些耐药患者中的HBx突变通过增加核cccDNA水平补偿核苷类似物对HBV复制的抑制作用［44］。

3.5 HBx突变影响HCC发生发展的机制

HBx基因区的碱基突变可引起对应的氨基酸改变，影响HBx蛋白的结构和功能，从而增强HBx的致癌潜能和HBV复制和免疫逃逸能力。A1762T和G1764A突变导致的HBx蛋白K130M和V131I突变是最常见的HBx突变类型，这两个突变常常一起出现，该类型突变可影响细胞周期调控基因的表达，促进细胞增殖和HCC的发生［45］。K130M/V131I突变，尤其是A1762T/G1764A/T1753A/T1768A组合突变（I127N/K130M/V131I/F132Y）可通过激活E2F1转录因子增强SKP2的转录，促进细胞周期抑制相关蛋白（p21、p53等）泛素化，从而促进细胞增殖［46］。在动物模型中K130M/V131I突变可通过激活AKT/FOXO1通路和影响花生四烯酸代谢诱导强烈的炎症反应，从而促进HCC进展［47］。野生型HBV可以激活HIF-1α而促进HCC的发生和发展，而K130M/V131I突变可以进一步上调HIF-1α的表达和转录活性［48］。K130M、V131I、K130M/V131I尤其是I127N/K130M/V131I/F132Y对细胞的迁移、增殖能力和Wnt/β-catenin信号通路的激活作用较野生型强［49］。

4 HBx影响信号通路和基因表达而直接致癌

HBx除了在HBV的复制、整合和进化中起关键作用，同时也作为一种重要的癌蛋白，参与多种HCC相关信号通路，影响关键基因的表达调控，从而促进细胞增殖、迁移、侵袭、耐药及诱导上皮间充质转化（EMT）和癌细胞干性，扰乱细胞代谢、影响DNA损伤修复等，发挥直接致癌作用［9］。

4.1 HBx参与的HCC信号通路

HBx在HCC发生发展过程中参与多条信号通路，其中备受关注的信号通路包括MAPK信号通路、NF-κB信号通路、Notch信号通路以及Wnt/β-catenin信号通路。HBx激活JNK信号通路，使PXN 178位点的丝氨酸磷酸化，从而促进HCC侵袭并导致不良预后［50］。lncRNA IHS同时受HBx和SMYD3调控，通过MEK/ERK信号通路促进HCC细胞迁移、侵袭和增殖［51］。HBx也能通过抑制miR-34a促进IKKβ诱导的NF-κB活化，以及诱导STAT3磷酸化，共同促进HMGB1表达和分泌，从而促进HCC的EMT进展和血管生成［52］。HBx还可通过激活HCC中的NF-κB信号通路上调CEBP/α，进而促进IL-34表达，最终导致HCC细胞增殖和迁移［53］。ZHX2与NF-YA相互作用能抑制Notch1转录，而HBx与转录因子CREB相互作用可促进miR-3188转录，下调ZHX2，降低ZHX2对Notch信号通路的抑制作用，从而诱导HCC的发生［54］。HBx还能下调PTEN而增强β-catenin/c-Myc信号通路，激活B7-H1的转录活性，增加PD-L1表达，抑制T细胞应答，促进HBV免疫逃逸［55］。HBx诱导的miR-5188也能损害FOXO1，从而刺激β-catenin核易位，激活Wnt信号通路，进而诱导肿瘤干细胞形成［56］。

4.2 HBx对基因表达的调控作用

4.2.1 HBx与转录因子相互作用 HBx蛋白是一种反式激活因子，但HBx本身不能直接与DNA结合，其转录活性是通过与多种转录因子相互作用，激活各种病毒和细胞的启动子和增强子，进而影响HCC的发生发展。如HBx与基础转录因子SP1协同作用，上调SWELL1［57］。HBx还可通过转录因子c-Jun激活LASP-1启动子活性，促进其表达［58］。

4.2.2 HBx与表观遗传修饰 表观遗传变化可影响编码和非编码基因的表达，促进HBV复制和HCC的发生发展。表观遗传改变可由多种因素引起，如病原体、化学物质、紫外线等。在HBV-HCC中，HBx被认为是影响表观遗传最重要的因素之一。HBx通过调节基因启动子的甲基化状态来调节下游分子表达。一方面，HBx上调DNMT3A表达并与DNMT3A相互作用，使PTPN13启动子区DNA甲基化水平升高，从而抑制PTPN13的转录［59］。另一方面，HBx可诱导RelA与EZH2、TET2和DNMT3L形成复合物，导致EpCAM的NF-κb侧CpG位点去甲基化，从而上调EpCAM表达［60］。HBx与MBD2以及CBP/p300相互作用可诱导MBD2-HBx-CBP/p300复合物形成，介导组蛋白H3和H4的乙酰化［61］。ZHX2是HCC相关肿瘤抑制基因，而HBx可促进 miR-155表达［62］，进而降低ZHX2水平。DLEU2是一种lncRNA，HBx可增强其转录并诱导其在感染肝细胞中积累，HBx与DLEU2以及EZH2结合，可解除EZH2对其靶基因的抑制作用，促进病毒复制以及下游宿主基因的转录激活［63］。HBx与SKP2结合也可导致SHIP2泛素化，促进HCC进展［64］。

5 小结与展望

HBx基因与其编码的蛋白通过促进HBV复制、整合到宿主基因组和发生变异，并调控关键基因表达和信号通路的激活，广泛参与到慢性肝炎-肝硬化-肝癌的发生发展过程中，在HBV-HCC发生、复发、侵袭转移、免疫逃逸中起重要作用。目前，HBx对HBV复制、基因表达调控等方面已经得到广泛的研究，流行病学证据表明突变型HBx与HBV-HCC的关系密切。突变型HBx具有比野生型HBx更强的致癌能力且与抗病毒治疗耐药相关，但突变型HBx在HBV-HCC发生发展以及耐药过程中的具体作用机制研究仍较少。今后进一步深入研究HBx及其突变的致癌机制及研发靶向HBx突变的药物，对HBV-HCC的预防、治疗和预后预测有重要意义。