外周血GPC3在肝细胞癌临床诊断中的价值

马小华 吴坤瑾 黄启超 曲凯 马磊

原发性肝癌是常见的消化道恶性肿瘤，其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是主要的病理类型，占原发性肝癌的85%～90%［1］。我国HCC新发病例和死亡病例约占全球的50%，严重威胁人民生命与健康［2］。HCC起病隐匿，确诊时多属中晚期，失去手术根治机会，5年生存率不足15%［3］。因此，早期诊断对改善HCC临床结局具有重要意义。目前，甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）是临床上HCC最常用的诊断标志物，但敏感性仅有20%～65%，且在其他肝脏良性疾病、胃肠道肿瘤等亦可检测到阳性结果［4］。因此，亟需寻找更敏感的诊断标志物提高HCC诊断效能。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）是GPC家族中的一员，是一类锚定在细胞膜上的癌胚蛋白［5］。越来越多证据表明HCC患者血清中GPC3蛋白与外周血GPC3 mRNA高表达［6-8］。此外，有研究显示GPC3可鉴别AFP阴性的HCC与肝脏良性结节［9］。因此认为，GPC3是极具潜力的HCC诊断标志物。本研究对GPC3蛋白和mRNA诊断HCC的研究进行Meta分析，同时评价GPC3联合AFP、异常凝血酶原（des-γcarboxy prothrombin，DCP）的诊断效能，以期为HCC早期诊断提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 文献收集

以“hepatocellular carcinoma”、“hepatocellular cancer”、“primary liver cancer”、“HCC”为 HCC的关键词，以“glypican-3”、“OCI 5”、“MXR 7”、“GPC3”为 GPC3的关键词，检索 PubMed、Web of Science、Embase和Cochrane library数据库获取相关文献，同时阅读参考文献扩大检索范围。检索时间限定为2000年1月至2021年6月，语言限定为英文。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：经病理诊断为HCC；检测血清GPC3蛋白或外周血GPC3 mRNA；前瞻性或回顾性队列研究；评估了血清GPC3蛋白或外周血GPC3 mRNA对HCC诊断的敏感度、特异度。排除标准：综述、评述、个案报道、会议摘要等；动物实验、缺乏对照组的人类研究；数据资料不完整的研究。

1.3 数据提取与质量评估

所检索获取的文献及其数据由两位研究者分别独立提取，并交叉核对，按照纳入和排除标准进行文献筛选。如遇分歧，则由第3位研究者决定是否纳入。数据提取内容包括：⑴纳入研究的基本情况，如作者、发表年代、试验对象所在地区、试验人数、检测样本来源、检测方法、诊断阈值等；⑵研究结果，包括真阳性、假阳性、真阴性和假阴性的例数。使用诊断准确性研究的质量评价工具（quality assessment of diagnostic accuracy studies，QUADAS）［10］进行文献质量评价，并由两位研究者独立进行评分，若存在分歧经讨论解决。

含有肝癌组织和正常肝组织GPC3 mRNA表达量的数据从癌症和肿瘤基因图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）下载，共纳入371例肝癌组织和50例正常肝组织。

1.4 免疫组化检测

GPC3和肝细胞石蜡抗原（hepatocyte paraffin-1，HepPar-1）的免疫组化样本来源于1例2021年5月于西安交通大学第一附属医院肝胆外科进行手术治疗并经术后病理确诊为HCC的患者，50岁，男性。该标本的使用经西安交通大学第一附属医院伦理委员会批准，患者知情同意。采用常规Elivision两步法进行免疫组化（immunohistochemistry，IHC）染色，GPC3抗体来源于福州迈新生物技术开发有限公司（货号MAB0067）；HepPar-1抗体来源于中杉金桥生物技术有限公司（货号ZM-0131），按抗体说明书使用。

1.5 统计学方法

采用MetaDisc 1.4软件进行Meta分析。阈值效应引起的异质性检验：计算Spearman相关系数及其P值；当P＜0.05，认为存在阈值效应引起的异质性；P≥0.05，认为不存在异质性。非阈值效应引起的异质性检验：采用Cochran-Q法进行检验；I2＜50%且P＞0.1提示研究间异质性较小，采用固定效应模型分析；I2≥50%且P≤0.1提示各研究间存在显著异质性，采用随机效应模型分析。汇总分析所纳入文献的敏感度（sensitivity，Sen.）、特异度（specificity，Spe.）、阳性似然比（positive likelihood ratio，LR+）、阴性似然比（negative likelihood ratio，LR-）、诊断性试验比值比（diagnostic odds ratio，DOR）指标及其95%置信区间（confidence interval，CI），绘制综合受试者工作特征（summary receiver operating characteristic，SROC）曲线。TCGA来源的肝癌组织和正常肝组织的GPC3 mRNA表达量数据采用Stata 15.0软件进行分析，组间比较采用独立样本t检验，以双侧P＜0.05为差异有统计学意义，用Graphad Prism 8.0软件绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线。

2 结果

2.1 GPC3在肝癌组织中的表达

GPC3蛋白由硫酸乙酰肝素核心铁链及其核心蛋白构成，分布在细胞膜表面。与HepPar-1表达结果相反，GPC3在肝癌组织中特异性高表达，正常肝组织不表达，免疫组化结果见图1。

图1 HCC组织中GPC3和HepPar-1的免疫组化染色结果（IHC×200）Fig.1 Immunohistochemical staining of GPC3 and HepPar-1 in HCC tissues(IHC×200)

2.2 文献检索结果

初检数据库获得相关文献1 140篇，排除重复325篇，经阅读标题、摘要排除个案报道、Meta分析及不相关文献667篇，剩余148篇阅读全文，阅读全文后经排除不相关及数据不全文献129篇，最终纳入文献19篇。纳入分析的19篇文献中，有关血清GPC3蛋白16篇，外周血GPC3 mRNA 5篇。

2.3 血清GPC3蛋白诊断HCC的效能

2.3.1 文献基本特征 纳入分析的16篇文献中包含3 963例患者，HCC 1 985例，对照组1 978例，文献基本特征见表1。

表1 纳入分析的16篇血清GPC3蛋白诊断HCC研究的基本特征Tab.1 Basic characteristics of 16 included studies on serum GPC3 protein in the diagnosis of HCC

2.3.2 异质性检验及质量评价 阈值效应的异质性检验结果显示，Spearman相关系数为0.474（P=0.787），提示不存在阈值效应引起的异质性。非阈值效应异质性检验结果显示，合并计算灵敏度和特异度的I2分别为94.2%和96.8%，且均P＜0.1，提示各研究间存在异质性，故后续采用随机效应模型合并效应量。纳入分析的16篇文献的QUADAS评分结果均≥10分，提示纳入文献质量高，偏倚风险低。

2.3.3 血清GPC3蛋白诊断HCC的价值 血清GPC3蛋白用于HCC诊断的Meta分析汇总的敏感度和特异度分别为0.62（95%CI：0.60～0.64）、0.67（95%CI：0.65～0.69），见图2。

图2 血清GPC3蛋白诊断HCC的合并敏感度和特异度Fig.2 Pooled sensitivity and specificity of serum GPC3 protein in the diagnosis of HCC

2.3.4 血清GPC3蛋白联合AFP或DCP诊断HCC的效能 血清GPC3蛋白单独诊断HCC的敏感度和特异度仅为0.62和0.67，SROC曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.75，提示诊断效能欠佳；与AFP联合检测诊断HCC的敏感度和特异度分别为0.82和0.81，AUC为0.90；与DCP联合检测诊断HCC的敏感度和特异度分别为0.74和0.76，AUC为0.82。见表2和图3。

表2 血清GPC3单独及其与AFP或DCP联合诊断HCC的效能Tab.2 Diagnostic accuracy of serum GPC3 alone and combination with AFP or DCP for HCC

图3 血清GPC3蛋白单独及其联合AFP或DCP诊断HCC的SROC曲线Fig.3 SROC curves of serum GPC3 alone and combination with AFP or DCP for diagnosis of HCC

2.4 外周血GPC3 mRNA诊断HCC的效能

2.4.1 文献基本特征 外周血GPC mRNA诊断HCC的文献检索过程同前，最终纳入文献5篇，包含636例患者，其中HCC 255例，对照组381例，基本特征见表3。

表3 纳入分析的5篇外周血GPC3 mRNA诊断HCC研究的基本特征Tab.3 Characteristics of 5 included studies on peripheral blood GPC3 mRNA in the diagnosis of HCC

2.4.2 异质性检验及质量评价 阈值效应的异质性检验显示，Spearman相关系数为-0.100（P=0.873），提示不存在阈值效应引起的异质性。非阈值效应的异质性检验显示，合并计算敏感度和特异度的I2分别为93.9%、96.8%，且均P＜0.1，提示各研究间存在异质性，后续采用随机效应模型合并效应量。纳入的5篇文献的QUADAS评分结果均≥10分，提示纳入文献质量高，偏倚风险低。

2.4.3 外周血GPC3 mRNA诊断HCC的价值 首先对来自TCGA数据库中371例肝癌组织和50例正常肝组织的GPC3 mRNA表达情况进行分析，结果显示，与正常肝组织相比，GPC3 mRNA在肝癌组织中高表达，相对表达量为6.083±3.174，正常肝组织为0.659±1.446（P＜0.0001），见图4A。外周血GPC3 mRNA诊断肝癌的AUC为0.91（95%CI：0.87～0.94），见图4B。对纳入的5篇文献进行Meta分析，汇总的敏感度和特异度 分 别 为 0.76（95%CI：0.70～0.81）和 0.87（95%CI：0.84～0.91），见图4C～D；AUC为0.92，见图5。

图4 肝癌组织中GPC3 mRNA的表达水平及其诊断效能Fig.4 Expression level of GPC3 mRNA in HCC tissues and its diagnostic efficacy

图5 外周血GPC3 mRNA诊断HCC的SROC曲线Fig.5 SROC curves of peripheral blood GPC3 mRNA for diagnosis of HCC

3 讨论

HCC起病隐匿，进展迅速，恶性程度高，迫切需要敏感度和特异度高的早期诊断方法。血清学检测生物标志物具有简便、快速、创伤小等优势，是早期诊断HCC的主要方法之一。目前研究确定的HCC血清学诊断标志物包括AFP、DCP和GPC3等［28-29］。本研究中免疫组化染色结果显示GPC3特异性高表达于肝癌组织，文献报道其阳性率可达 70%～90%［30-31］。GPC3蛋白含有580个氨基酸，Arg（358）和 Ser（359）之间可被蛋白酶水解，产生一个40 kDa的N端亚基和一个30 kDa的C端亚基，可分泌至血清中［32］，是HCC特异性的血清诊断标志物，在HCC患者中阳性率可达36.1%～95.0%［6］。同时在HCC患者外周血检测中发现GPC3 mRNA阳性率为28%～100%，在HCC诊断中显示一定潜力［16］。因此，本研究分别从血清GPC3蛋白和外周血GPC3 mRNA两方面评估GPC3对HCC的诊断价值。

本研究中，血清GPC3蛋白诊断HCC的Meta分析最终纳入16篇文献，合并灵敏度和特异度分别为0.62和0.67，提示血清GPC3蛋白用于HCC诊断的效果欠佳。外周血GPC3 mRNA诊断HCC的合并灵敏度和特异度可达0.76和0.87，在绘制的SROC曲线中，外周血GPC3 mRNA的AUC值为0.92，显著高于GPC3蛋白的0.75。上述结果提示，与血清GPC3蛋白相比，外周血GPC3 mRNA检测具有更高的诊断效能。这可能得益于以下两方面因素：⑴与血清中游离的核酸及蛋白相比，来源于外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）及细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）的mRNA受到以脂质体为主的细胞膜或囊泡的保护，在外周血中更稳定，不易降解［33-34］。WANG等［27］在肝癌研究中发现，与AFP蛋白不同，EV来源的AFP mRNA表达量在新鲜血液与储存3年后的样本中没有明显差异，比血清来源AFP蛋白更为稳定。⑵与检测血清蛋白相比，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）及其相关技术检测灵敏性更强，具有放大作用，能检测出微量的RNA，从而使诊断效能提高。然而本研究中纳入的有关外周血GPC3 mRNA诊断HCC的文献仅有5篇，尚缺乏大样本的临床研究证实。同时本研究纳入的GPC3 mRNA样本来源及检测方法不一，结果也具有一定局限性。因此，后续可开展大样本、多中心的临床研究进一步确认GPC3 mRNA在HCC诊断中的应用价值。

与单独检测AFP一样，单独检测GPC3存在一定假阳性和假阴性现象，因此很多研究支持两项或多项诊断标志物联合用于早期HCC诊断［35-36］。在本研究中，单独检测血清GPC3蛋白诊断HCC的敏感度、特异度分别为0.62和0.67；联合AFP诊断的敏感度和特异度分别达0.82和0.81；联合DCP的敏感度和特异度分别为0.74和0.76。以上结果表明血清GPC3蛋白联合AFP或DCP可明显提高HCC的诊断效能。与其他Meta分析结果比较，本研究中血清GPC3蛋白对HCC诊断效能的Meta分析结果与LIU等［37］研究结果一致，提示单独血清GPC3蛋白用于HCC诊断效能欠佳。在联合检测上，本研究与XU等［35］的Meta分析结果一致，均提示血清GPC3蛋白与AFP联合检测有助于HCC早期诊断。但与之相比，本研究纳入了更多的文献，并对联合AFP或DCP的诊断效能进行比较，因此研究结果更具说服力。目前尚未见外周血GPC3 mRNA用于HCC诊断的Meta分析报道，因此本研究结果对HCC诊断具有一定参考价值。

本研究也存在一定局限性：⑴纳入文献均为英文文献和已发表文献，未纳入其他语种及未发表或未出版的文献，结果可能存在一定偏倚；⑵纳入文献的研究例数普遍较少，缺乏前瞻性、大规模的临床诊断研究。

综上所述，基于本项Meta分析结果显示，在HCC诊断中，与血清GPC3蛋白相比，外周血GPC3 mRNA检测可能具有高的诊断效能，但缺乏大样本的临床研究证实，有待设计前瞻性、大规模临床试验进一步评估其诊断效能。此外，单独检测血清GPC3蛋白虽然对HCC的诊断价值有限，但与AFP或DCP联合检测可明显提高其诊断效能，可能是HCC早期诊断的潜在有效组合。