Wnt 信号通路与肝纤维化的关系

范 钦， 李红俊， 李晓霞， 杨 尹， 陈海燕， 成家茂

1 大理大学基础医学院 解剖学教研室， 云南 大理 671000；2 大理大学临床医学院 超声教研室， 云南省第四人民医院 超声科， 云南 大理 671000

肝纤维化是慢性肝损伤后进一步恶化的关键性病理过程，是提升肝癌风险的关键因素，目前尚无特异有效的治疗方法。多种信号通路参与肝纤维化的调控，包括TGFβ、Hedgehog、Wnt、Notch、MAPK、PI3K、NF-κB、Rho、S1P等信号通路。其中，Wnt是一个广泛存在且高度保守的信号，在创伤修复和纤维化形成过程中与许多器官如肝、肾、肺和心脏的纤维化发生有关[1-2]。越来越多的研究[2]表明，靶向Wnt信号可能是一种新的、有前途的抗纤维化策略。因此，本文就Wnt信号通路及其在肝纤维化中的调控作用进行综述。

1 Wnt信号通路

1.1 经典Wnt信号通路及其激活 Wnt经典途径即依赖β-catenin的Wnt/β-catenin信号通路(图1)，β-catenin是钙黏蛋白复合物的核心成分，其稳定性对于Wnt/β-catenin信号通路的激活至关重要[3-4]。Wnt信号通路经典途径包括配体、跨膜受体、胞浆调节蛋白、核内转录因子及下游靶基因。Wnt 蛋白是一类富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白，其异常激活还与衰老、肿瘤、炎性和器官纤维化等疾病密切相关[5-8]，而Wnt受体卷曲蛋白(Fzd)及其共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5/6同样富含半胱氨酸结构域，通过此区域二者可直接与 Wnt蛋白特异性结合，形成复合物Wnt-Fzd-LRP5/6，从而启动经典Wnt信号通路的激活[9-10]。在缺乏Wnt配体的情况下，β-catenin与支架蛋白(Axin)、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)以及酪蛋白激酶1α(CK1α)结合形成β-catenin蛋白降解复合物即“破坏复合体”，致使GSK-3β和CK1α将β-catenin磷酸化，并促进其降解。Wnt信号一旦被激活，便开始招募并激活蓬乱蛋白 (disheveled，Dsh/Dvl)，促进Axin、GSK-3β与LRP联系，从而破坏“破坏复合体”的活性，β-catenin不能被降解并在胞质中积累，随后进入细胞核，取代T淋巴细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)家族的转录抑制因子Groucho蛋白与之结合，诱导Wnt下游靶基因的转录表达[3,11-12]，从而发挥多种生物学作用。因此，Wnt信号通路可概括为：Wnt激活→Wnt-Fzd-LRP5/6复合物形成→Dsh/Dvl活化→β-catenin蛋白降解复合体解散→β-catenin入核 →取代TCF/LEF→下游基因转录表达。

1.2 非经典Wnt信号通路及其激活 包括3种非依赖β-catenin的信号通路，即Wnt/Ca2+通路、Wnt/PCP通路、调控纺锤体定向和非对称细胞分裂的胞内信号通路(SO-ACDic)[3-4,11-13]。以上3种信号通路虽均无β-catenin的参与，但需要Wnt蛋白与受体Fzd结合，然后信号被转导至Dsh/Dvl，不使用LRP5/6作为其共同受体[12](图1)。非经典Wnt信号通路主要作用于细胞迁移和细胞极性[3]，其Wnt蛋白家族包括Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a和Wnt11等。此类通路的β-catenin在胞浆内与APC-Axin-GSK-3β复合体结合并被磷酸化，磷酸化的β-catenin被β-转导重复相容蛋白(β-Trcp)识别并泛素化，随后被蛋白酶体降解。在哺乳动物中，Wnt/PCP通路是高度保守的信号传导路径，它参与了激活c-Jun N-末端激酶(JNK)和Ras同源基因家族成员A(RhoA)级联，从而靶向控制细胞骨架重排的基因；Wnt/Ca2+途径主要通过调节细胞内Ca2+升高，随后异三聚体G蛋白和磷脂酶C(PLC)及其蛋白激酶C(PKC)被Wnt-Fzd 复合物激活，然后激活下游靶基因的表达，从而控制细胞分化的结局，细胞的黏附和迁移[12]。目前，有关SO-ACDic信号通路的研究较少[14]。

图1 Wnt信号通路的经典途径和非经典途径[3-4]

2 Wnt信号通路与肝纤维化

2.1 Wnt信号通路与肝星状细胞(HSC)的活化 HSC在肝纤维化的发生和发展中起着重要或关键性的作用[15-16]。在正常肝脏中，HSC以静止状态存在于肝细胞与其周围肝血窦内皮细胞之间的Disse腔中，呈梭形或多边形，因胞浆内有多个富含维生素A的脂滴，故又称Ito细胞或贮脂细胞，可参与肝窦血流的调节，并分泌多种胶原酶和基质金属蛋白酶(MMP)[16-17]；当肝脏受到损伤和发生纤维化时，HSC激活并发生表型改变，转化为肌成纤维细胞(MFB)，可表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白、结蛋白等特征性蛋白，大量分泌主要来源于Ⅰ型和Ⅲ型胶原的细胞外基质，在Disse腔的胶原化过程中起主要作用[15]。另一方面，在肝纤维化过程中，TGFβ、血小板源性生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子、结缔组织生长因子、表皮生长因子、肝细胞生长因子等细胞因子共同激活HSC增殖、迁移和分泌的信号通路[15-16]，包括TGFβ、Wnt、Hedgehog、NF-κB、Notch、ROCK、MAPK、PI3K等大量通路，以及新发现的NLRP3、Ferroptosis 等信号通路[18-20]。

Wnt信号通路与HSC的活化关系密切，可通过以下几种主要途径实现调控。(1)细胞命运决定和形态发生因子：研究[21-23]显示，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ为脂肪细胞和HSC的分化所必需，可促进脂肪在HSC内的储存，Wnt/β-catenin与PPARγ、Smads、Shh、NF-κB、Necdin、Notch、DLK1等多种形态发生素相关转录因子相互作用，在HSC转分化为MFB的过程中被激活。(2)Wnt信号相关蛋白酶：近期研究[24]表明，CCl4诱导肝纤维化小鼠的原代HSC中和TGFβ1刺激的LX-2细胞中Polo样激酶1(PLK1)的表达均有升高，敲除PLK1则可抑制细胞内α-SMA和Col1α1的表达，降低HSC的活化，促进HSC凋亡，而Wnt/β-catenin信号通路可能为PLK1介导的HSC活化所必需。Du等[25]实验发现，采用血红素加氧酶-1(HO-1)诱导HSC-T6，能够下调经典Wnt途径的关键调节因子 Wnt1和非经典Wnt途径的关键调节因子Wnt5a；而采用氯化血红素诱导则可抑制Wnt途径中β-catenin和激活T淋巴细胞核因子5的下游因子，表面HO-1通过抑制HSC的生长和促进其凋亡在肝纤维化中发挥保护作用。(3)微小核糖核酸(miRNA)：miR-708可通过Wnt/β-catenin信号通路直接靶向跨膜蛋白TMEM88，通过调节Wnt3a、Wnt2b、Wnt3α的表达及Dvl-1的PDZ结构域，促进HSC的活化和细胞外基质的积累[26]。但另有研究[27]发现，miR-708在纤维化肝组织和活化的HSC中表达受到抑制，伴随着ZEB1水平的增加，而其过表达和ZEB1的沉默抑制了LX-2细胞的活化与增殖。miR-16可同步靶向整合TGFβ信号通路的Smad2和Wnt信号通路的Wnt3a 等，从转录组水平诱导HSC向MFB表型转化的逆转，导致肝纤维化的消退[28]。日本血吸虫卵源性外泌体Sja-miR-1可显著增加原代小鼠HSC和LX-2细胞内α-SMA、Col1-α1及Col3-α1 mRNA的表达，促进了HSC的活化[29]，而Sja-miR-71a可通过直接靶向 Sema4D来抑制TGFβ1/SMAD和IL-13/STAT6信号途径，以及通过调节Th1/Th2/Th17和Treg 的平衡来抑制肝纤维化[30]。(4)其他信号相关蛋白：特异性顶部盘状底板反应蛋白(R-spondin protein，RSPO)为Wnt/β-catenin信号激活因子，研究[31]发现，RSPO3在多器官纤维化的发展中起着关键作用，即抗RSPO3抗体OMP-131R10在治疗性给药时，可减轻肝纤维化、肺纤维化和皮肤纤维化，并认为RSPO3在Kupffer细胞和肝细胞中诱导多种促纤维化的趋化因子和细胞因子。Yes 相关蛋白(YAP)是Hippo信号通路中的主要下游蛋白，在CCl4诱导小鼠肝纤维化组织和经TGFβ1处理的HSC-T6细胞中均表达升高，而YAP的缺失可减弱HSC-T6细胞内Wnt/β-catenin信号途径的活性[32]。Dickkopf-1(DKK-1)是一种分泌性蛋白，可与Wnt受体LRP5/6及穿膜蛋白Kremen1/2结合形成三聚体，阻断Wnt/β-catenin信号向胞内的传递，在慢性HCV相关肝硬化患者中出现显著升高[33]。β-连环蛋白2相关拮抗剂(Dact2)是一种Wnt信号相关肿瘤抑制因子，Dact2基因的敲除可增强肿瘤侵袭和迁移相关的MMP2、MMP9基因的表达，以及与上皮间质转化相关的 Snail、VEGF和ZEB基因的表达，也与胰腺和肝脏的纤维化密切相关[34]。锌指E-盒结合同源异型盒蛋白(ZEB)是锌指家族的功能蛋白，ZEB1在包括肝纤维化和丙型肝炎在内的多种肝脏疾病中异常表达[35]；ZEB2可通过Wnt/β-catenin信号通路促进肝纤维化的发生发展[27]。

2.2 Wnt信号通路参与肝Kupffer细胞的极化 巨噬细胞通常根据表型和功能分为经典活化巨噬细胞(促炎型，M1-Mφ)和替代性活化巨噬细胞(抗炎型，M2-Mφ)，此外还有肿瘤相关巨噬细胞、CD68+、CD169+和TCR+巨噬细胞等；也可按其分布分为固定性巨噬细胞(如肝、脾、淋巴结的巨噬细胞等)和游走性巨噬细胞(如肺、表皮和腹腔的巨噬细胞等)。M1、M2型属单核细胞活化后一系列功能状态的两个极端，其分化受各种微环境信号的诱导与调节。正常肝脏内主要为固有巨噬细胞即Kupffer细胞，在肝损伤中则由外周血单核细胞衍生的浸润巨噬细胞和Kupffer细胞两部分组成[36]。

Wnt信号通路与纤维化器官中巨噬细胞的极化关系密切。早期研究[37]发现，小鼠肝内有14个Wnt、7 个Fzd基因在正常和活化的HSC及Kupffer细胞中表达。当前已有许多研究证明Wnt信号可介导巨噬细胞参与多器官的纤维化形成。Wnt5a通过刺激Yap/Taz介导的M2-Mφ极化来促进肾纤维化[38]。Wnt7a可与肺间充质干细胞(LR-MSC )的Fzd1结合，通过在脂多糖或IL-4诱导极化的M2-Mφ中表达增多，促使LR-MSC向MFB的分化和博来霉素诱导的肺纤维化形成[39]。虽然通过巨噬细胞极化激活Wnt信号以促进肝纤维化的作用机制研究较少，但经Wnt配体如Wnt2b、Wnt3a、Wnt3、Wnt 4、Wnt 10b和Wnt 11等活化的Kupffer细胞、肿瘤相关巨噬细胞和Hepa1-6细胞在肝细胞癌的发生、发展和迁移中却发挥着重要的作用[40-42]。关于Wnt信号介导肝巨噬细胞或Kupffer细胞调控肝纤维化的研究已不断深入开展。Corbett等[43]研究发现，Wnt5a在活化的HSC中表达，可通过非经典途径的Dvl2和pJNK磷酸化，刺激HSC或Kupffer细胞，分别调节HSC的凋亡和TGFβ1、单核细胞趋化蛋白1的表达，并提出活化的HSC可通过非经典途径Wnt信号启动自分泌和旁分泌作用，参与肝纤维化的形成。Akcora等[44]研究发现，经典途径的Wnt配体Wnt1、Wnt3a和Wnt10b，Wnt受体Fzd1、Fzd2及其共受体LRP6在CCl4诱导肝纤维化大鼠和 TGFβ诱导的3T3成纤维细胞中均显著上调，趋化因子CXCL12可通过经典的Wnt/β-catenin途径促进HSC活化，刺激巨噬细胞向肝脏募集，增强肝内炎症、血管生成和纤维化，而Wnt/β-catenin/TCF介导的转录抑制剂 ICG-001则可减轻这些反应。

2.3 Wnt信号通路与肝祖细胞(hepatic progenitor cell，HPC)的活化 HPC为肝内一类具有干细胞功能特点的未分化细胞，又称卵圆细胞，可分化为肝细胞或胆管上皮细胞[45-46]。近几十年的证据显示，在脂肪肝原位肝移植后和胆汁淤积的胆总管结扎模型中，HPC发生间质转化并导致肝纤维化，并有HSC、巨噬细胞、肝窦内皮细胞等胆管周围细胞集群的参与，尤其是在慢性肝损伤后的晚期肝纤维化或肝硬化中有助于肝再生，生成新的肝实质细胞[46]。在慢性肝病中，调节HPC的因素在很大程度上仍然未知，但最近有报道[47]显示，Wnt、Notch、YAP35和Hedgehog信号均参与调控HPC。

Boulter等[48]研究发现，在人类病变肝脏和胆管炎小鼠模型中，MFB通过Notch配体Jagged1的表达启动HPC内的Notch信号，促使HPC向胆管细胞的分化；而巨噬细胞通过诱导Wnt3a的表达启动HPC内的经典Wnt信号，从而维持HPC内命运决定因子Numb的表达，并促进HPC向肝细胞分化这一特性。Carpino等[49]研究发现，在儿童非酒精性脂肪性肝病中，M1-Mφ的极化与非酒精性脂肪性肝病的活动评分、胆管反应和门静脉纤维化密切相关，并伴随着巨噬细胞内Wnt3a的表达，关系到HPC内的β-catenin磷酸化及其对肝细胞命运的应答，表明巨噬细胞的极化可通过Wnt3a产生驱动HPC的应答，对儿童非酒精性脂肪性肝病的进展发挥关键性作用。

研究[50]显示，在乙硫氨酸诱导的小鼠肝损伤中，通过下调Atg5基因的表达以抑制自噬，可阻碍HPC的分化和抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，并发现在人的肝纤维化组织中，自噬可通过调节体内Wnt/β-catenin信号来调节HPC的肝细胞分化。在向肝细胞分化的大鼠HPC细胞系WB-F344中，自噬可高度激活HPC并在分化为肝细胞的过程中逐渐减弱，同时出现Wnt3a信号下调而Wnt5a信号上调，表明自噬可通过Wnt信号通路调节HPC的肝细胞分化[51]。

3 小结

Wnt信号与肝纤维化的相关性研究是抗肝纤维化治疗不容忽视的一个问题。肝内不同细胞通过分泌细胞因子或转录因子而发挥调控Wnt信号通路以及其他信号通路的作用，如TGFβ1、JAK/STAT、Hedgehog、NF-κB、Notch、Necdin、MAPK、BMP2等。围绕Wnt信号如何参与细胞内调节，研究者们从HSC或Kupffer细胞或HPC方面做了详细的分析。除以上角度外，笔者认为Wnt信号还可能与细胞自噬、细胞形态发生与分化、上皮细胞-间充质转化、肠道微环境等存在密切的联系。虽然众多学者对于Wnt信号调控肝纤维化发生发展和转归的具体机制进行了多方面的研究，但在这些研究中尚存在部分欠缺与不足。未来进一步深入研究Wnt信号与肝纤维化的关系，将对探索可控制甚至可逆转肝纤维化的发生发展具有重要临床意义。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：范钦、李红俊、李晓霞、杨尹负责查找文献，资料分析，撰写论文；成家茂、陈海燕负责拟定写作框架，指导思路并修改稿件和最后定稿。