汝城白毛茶叶片特征研究

丁慧敏，陈芳芳，何朵英，李 娟，文海涛*

1. 湖南农业大学 园艺学院，湖南 长沙 410128；2. 汝城县农业农村局，湖南 汝城 424100

汝城白毛茶（Camellia sinensis var. assamica cv. Rucheng）属湖南省珍稀野生茶树品种资源之一，是国内罕见珍贵的大叶多毛野生茶[1]，其叶片大，多茸毛，独特的生长环境成就了汝城白毛茶独特的品质[2-3]。目前，对汝城白毛茶的研究大多集中在其功效、品质化学特性、加工工艺和种质资源调查等方面[4-6]，关于汝城白毛茶叶片特征的系统研究相对较少。国内外关于该品种叶片形态结构与生态适应性、种质资源开发利用等相互关系的研究尚未见报道。

茶树叶片是茶树收获的主要物质原料，是茶树进行一切生理活动的基础，是茶树生长最重要的器官。茶树叶片特征不仅可以作为识别植物并进行分类的依据之一，也可以作为初步判断品种部分生理功能的依据。利用茶树叶片解剖结构预测或判断茶树的生态适应性，是较为直观简便地判断茶树抗性品质的方法[7]。此外，茶树叶片的解剖结构还与茶树的抗病虫性密切相关[8-12]。可见，对汝城白毛茶叶片特征研究可为优良单株选育及其开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料为2021年3月27日取自湖南汝城县三江口瑶族镇兰洞村的汝城白毛茶，选生长状况良好植株，采15组单株于敞口装有水的密封袋中并编号。石蜡切片所需样品选一单株取其芽头、一芽一叶、一芽二叶和成熟叶片，储存于FAA固定液中。

主要试剂：38%甲醛、冰醋酸、甘油、1%番红水溶液（水配制）、1%固绿酒精溶液、二甲苯、石蜡、2.5%的戊二醛、0.1%的多聚赖氨酸。

1.2 方法

1.2.1 外部特征观测

选取生长状况良好的单株，每一单株随机选取6片成熟叶，用卷尺测量所选取单株的成熟叶片的叶长和叶宽，测定15个单株，记录数据，通过计算结果判断其叶形和叶型。

通过直接观测，判断叶片的叶色、叶质、叶面、叶尖等性状。

叶型是根据叶片的长宽比确定的，叶面积=叶长×叶宽×0.7，按叶面积大小分为特大型叶（面积＞ 50 cm2）、大型叶（面积 28 ～ 50 cm2）、中型叶（面积14 ～ 28 cm2）和小型叶（面积＜14 cm2）。根据叶形指数确定叶形，叶形指数=叶长/叶宽，一般可分为圆形（叶形指数≤2.0）、椭圆形（叶形指数2.1 ～ 2.5）、长椭圆形（叶形指数2.6 ～ 2.9）和披针形（叶形指数≥3.0）。

1.2.2 叶片外表皮观察

采用扫描电子显微镜观测。截取0.5 cm×0.5 cm的茶叶叶片组织块放在预先切好的同样大小的涂抹了0.1%多聚赖氨酸的载玻片上，然后用2.5%的戊二醛固定4 h。将固定好的样品用缓冲液冲洗3次后用不同浓度的乙醇进行脱水处理，浓度设置为30%、50%、70%、90%和100%，各10 min。用100%的乙醇脱水后，用100%叔丁醇与乙醇进行置换2次，每次10 min[10]。对样品进行真空冷冻干燥，拿出后用导电胶将干燥后的样品固定于样品台上，用20 mA的电流溅射镀金30 s，最后送入扫描电镜样品室观察[13-14]。

1.2.3 解剖结构观测

茶树叶片尤其是成熟的茶树叶片叶质地较硬，角质层和叶片都较厚，纤维化程度高，徒手切片具有较大的难度[15]。因此，茶树叶片切片不同于一般植物叶片的切片，茶树叶片解剖结构鉴定方法均为石蜡切片法。方法如下：

取材：将汝城白毛茶不同成熟度以叶脉为中轴裁剪成0.5 cm×0.5 cm的正方形，芽头截取长为0.5 cm的中间部位，立即置于FAA固定液（甲醛-冰醋酸-甘油）中。因成熟叶片较厚且硬，放置在软化液中的时间较其他叶片要长。

脱水：用不同浓度的乙醇脱水，每级浓度溶液停留 2 h。

透明：在通风橱中用二甲苯试剂进行组织透明。

浸蜡：对透明后的组织材料浸蜡4次，每次 6 ～ 8 h。

包埋：最后将材料包埋在石蜡中（熔点在50℃ ～ 60℃）。

切片：将样品放入切片机进行切片，然后展片、脱蜡。

染色：先用1%的番红水溶液染色1 ～ 2 h后，用蒸馏水洗涤3 ～ 5次；再用1%的固绿染色30 ～ 60 s后，将装片浸泡在75%的乙醇溶液中1 min后取出晾干。

透明封片：加入干净透明的二甲苯透明5 min，再加树胶于材料表面盖上盖玻片-树胶封片，封片后把切片放在37℃的恒温箱中干燥[15]，制成永久性切片。

镜检：置于显微镜下镜检，对切片进行图像采集。

1.2.4 数据分析

数据处理软件应用Excel 2019，对测定的每一组数据取平均值，组间再取平均值，根据平均值进行分析。

2 结果与分析

2.1 叶片外部特征

汝城白毛茶叶片的叶面积平均值为30.1 cm2（＞30 cm2），属于大型叶。叶型指数平均值为2.8，属于长椭圆形，部分为椭圆形（表1）。

汝城白毛茶是近年用湖南省汝城县野生大叶白毛茶驯化栽培后的茶树群体品种，野生大叶白毛茶叶片大，叶片最长可达27.8 cm，最宽可达11.8 cm。从表1可以看，野生大叶白毛茶经过驯化栽培后，叶长和叶宽都有所减小，但从叶型和叶面积来看，其仍属于大叶型，叶形为长椭圆形，部分为披针形和椭圆形。

表1 成熟叶片数据Table 1 data of mature leaves

结合图1、图2和表2结果：汝城白毛茶叶片较大，叶尖较长，多数为急尖，部分为渐尖，只有12号为钝尖；叶色多深绿，也有少数黄绿色和绿色；叶缘稍外卷，平展和波浪各有两组，叶质厚且硬脆，芽叶叶背生有许多茸毛，成熟叶叶背几乎看不到茸毛。多数叶面微隆起或隆起，只有12号为平滑。芽叶分为两种：色泽分别为黄绿和紫绿（图2A和图2B），芽叶背面多茸毛，相较于成熟叶，芽叶的叶缘外卷更明显（图2C）。芽头肥壮，茸毛特别多，百芽重121.3 g（图 2D）。

图1 汝城白毛茶成熟叶Figure 1 mature leaf of RuCheng white hair tea

图2 汝城白毛茶芽叶Figure 2 bud and bud leaves of RuCheng white hair tea

2.2 叶片外表皮特征

通过电镜扫描图片可看出，汝城白毛茶芽头的茸毛茂盛，茸毛布满整个芽头（图3A1、图3A2）；气孔被遮挡，看不到其他的部分。芽叶叶片背面气孔较成熟叶片少，蜡质层很薄（图3B1、图3C1）；叶背茸毛多，遮挡了部分气孔（图3B2、图3C2）。绿色芽叶和紫色芽叶在气孔、蜡质层和茸毛方面没有明显差异，外表皮特征基本一致。一芽二叶的茸毛明显要多于一芽一叶，因茸毛较多，只能透过茸毛看到部分气孔（图3D1、图3D2）。成熟叶片下表皮的气孔密集，气孔由两个肾形保卫细胞组成，呈椭圆形；气孔周围有蜡质层包围，蜡质层较厚，呈褶皱状（图3E1）；叶片背面茸毛很少（图3E2）。

图3 叶片背面电镜扫描图Figure 3 Electron microscope scanning of back of leaves

综合来看，茸毛的疏密程度为芽头最密，成熟叶茸毛最稀疏。芽叶背面的茸毛均指向叶尖，并与叶面具有一定的倾斜角度。气孔的数量随着成熟度增大而增加，成熟叶片面积最大，气孔数量多，相应地蒸腾作用也就越强。

2.3 不同成熟度叶片解剖结构特征

为更好地观察分析汝城白毛茶叶片的解剖结构，选取了桃源大叶和黄金茶的成熟叶及芽头作为对照。经番红-固绿染色后，木质化细胞壁呈红色，纤维素细胞壁呈绿色。

2.3.1 芽头解剖结构

从图4可看出，芽头上下表皮细胞外被角质层，上表皮细胞大于下表皮细胞，上表皮细胞呈矩形，下表皮细胞形状不规则，呈圆形、卵圆形或长椭圆形，上下表皮细胞均排列紧密，彼此镶嵌；三个品种的厚角组织都较发达，中脉有一个大的维管束，维管束不发达，呈新月状（图4A1、图4B1、图4C1）。汝城白毛茶和黄金茶芽头的栅栏薄壁组织和海绵组织二者细胞形态相似，分化程度低，栅栏组织细胞呈长柱形，海绵组织细胞呈长椭圆形，部分也呈长柱形（图4A2、图4C2）。桃源大叶芽头的栅栏组织和海绵组织尚未分化，组织细胞均呈圆形或卵圆形，尚未见到长柱形的栅栏组织细胞（图4B2）。

图4 芽头解剖图Figure 4 Anatomical structure of bud

2.3.2 一芽一叶和一芽二叶解剖结构

一芽一叶解剖结果如图5所示，上下表皮细胞外被角质层，上下表皮均为单层细胞，上表皮细胞稍大于下表皮细胞，表皮细胞形状不规则，大多呈卵圆形，排列紧密；中脉厚角细胞数量多，厚角组织发达；中脉有一个大的维管束，呈新月状，维管束和成熟叶相比欠发达（图5A1、图5B1、图5C1）。栅栏组织和海绵组织分化不是特别明显，栅栏组织细胞呈长柱形，栅栏薄壁组织为两层（图5A3）。木质化细胞很少，几乎不着红色（图5A1）。

图5 一芽一叶解剖结构Figure 5 Anatomical structure of a bud and leaf

一芽二叶解剖结果如图6所示，上下表皮细胞外被角质层，上表皮细胞稍大于下表皮细胞，上下表皮细胞排列紧密，呈不规则性；栅栏薄壁组织排列紧密，有两层，大多呈长柱形，部分为不规则性。海绵组织细胞排列紧密，形状不规则，呈矩圆形或卵圆形，栅栏薄壁组织与海绵组织的分化不明显（图6A3）；中脉有一个大型维管束，呈近半圆形，维管束发达程度较一芽一叶高。中脉附近有大型泡状细胞分布（图6A2），经过番红-固绿染色后，部分木质化的细胞呈红色(图6A1)。

图6 一芽二叶解剖结构Figure 6 Anatomical structure of one bud and two leaves

2.3.3 对夹叶解剖结构

结果如图7所示。叶片上下表皮细胞外被角质层，上下表皮细胞均为单层，上层细胞较大，呈不规则形，细胞间彼此凹凸镶嵌，排列紧密。下表皮细胞较小，多为圆形和卵圆形。叶肉组织发达，栅栏组织由两层排列整齐的长柱形细胞组成；海绵组织细胞形状呈不规则形，排列稍疏松。中脉有一个大型维管束，维管组织是轮状的，组成轮状维管组织的每个维管束间有1～ 3列细胞的细胞壁已经木质化，且包围在维管束外的纤维也连成环状；木质部发达，有发达的木纤维。

图7 对夹叶解剖图Figure 7 Anatomical structure of leaf to the clamp

2.3.4 成熟叶片解剖结构

成熟叶片的解剖结构如图8所示。通过观察三个品种的成熟叶片解剖图可看出，这三个品种茶树叶片上下表皮细胞外被角质层，且较厚。叶片表皮都由单层细胞构成，上表皮细胞较下表皮厚，表皮细胞呈卵圆形或圆形，栅栏组织为一层或两层。叶片中脉处维管组织是轮状的，导管呈链状排列。汝城白毛茶叶片的中脉组织细胞有一部分细胞的细胞壁已经木质化，有发达的木纤维，中脉厚角细胞数量较桃源大叶和黄金茶数量多，厚角组织发达（图8A1）。中脉和叶片组织的维管束发达，栅栏组织与海绵组织分化明显，栅栏薄壁组织为两层，呈长柱形且排列紧密；海绵组织排列疏松且细胞形状多样，细胞间间隙较大（图8A2）。

图8 成熟叶片解剖结构Figure 8 Anatomical structure of mature leaf blade

3 结论与讨论

叶片的宏观特征可以作为识别植物并进行分类的依据之一，也可作为初步判断品种部分生理功能的依据。一般来说，叶片下表皮的气孔密度较上表皮的气孔密度大，并且在高强光照射下生长的植物通常比低强光下的植物具有较高的气孔密度。通过观察，汝城白毛茶的气孔密度适中，初步判断其不属于高强光照射下生长的植物。除此之外，茶树芽叶茸毛的有无与疏密程度是茶树品种的主要经济性状之一，鲜叶制作成产品后，茸毛可作为评定茶叶外形和品质的重要因素[16]。汝城白毛茶以其芽叶肥壮、芽头茸毛满披而得名，十分具有代表性，这也是作为初步鉴别这一品种和其他品种的依据之一。有研究证明，根据叶片性状表现，单株叶片小、叶质厚，叶面隆起基本可以表明茶树抗寒性较强[17]；茶树芽叶的茸毛对一些病虫害如茶尺蠖、茶橙瘿螨、假眼小绿叶蝉等具有一定的抗性[18]。观察结果表明，该品种叶片大、叶质厚，叶面微隆起，茸毛密集，因而初步判断其抗寒性稍好，抗茶树病虫害能力较强。

叶片的解剖结构是茶树进行一切生理活动的基础，它与茶树的产量、品质、抗逆性和光能利用率等密切相关。外表皮角质层厚，叶片上表皮较下表皮厚，可以避免因阳光直射而灼伤叶肉细胞；下表皮较薄，有利于植株与外界进行气体交换和叶片的蒸腾。叶片进行光合作用的主要部位是叶肉，在叶肉组织中，栅栏薄壁组织和海绵薄壁组织间的厚度差异直接影响植株的光合作用效率。栅栏组织厚度也是抗高温干旱的重要鉴定指标之一，栅栏组织厚度越大，抗性越强[19]。有研究表明，海绵组织与品种的适制性密切相关[20]。叶肉的栅栏组织发达、海绵组织相对减少可以提高光合效率和水分利用率。通过观察该品种不同成熟度叶片以及对比观察汝城白毛茶、黄金茶和桃源大叶的成熟叶及芽头的解剖结构，可以得出：这三个品种均为典型的异面叶，叶片两面的内部结构不同，通常是上叶面主要受光，其叶肉细胞呈紧密垂直状排列，形成光合作用效率很高的栅栏组织，颜色深绿。而下叶面主要背光，其叶肉细胞分布松散，形成光合作用效率较低的海绵组织，颜色浅绿。汝城白毛茶幼嫩芽叶的栅栏组织和海绵组织的分化程度不高，维管束发达程度稍低，中脉的大型维管束呈新月形或半圆形，木质化程度较低。成熟叶片和对夹叶维管束较发达，木质部导管径向呈放射状排列，呈长圆形，木质部靠近下表皮的方向较发达，靠近上表皮的方向欠发达，并具有发达的木纤维，能够起到支持叶片的作用[21]。外表皮被有角质层，上表皮较下表皮厚，说明其保水和吸水能力较强；除了成熟叶的栅栏组织为两层外，其余成熟度叶片的栅栏组织为一层，一芽一叶、芽头的栅栏组织和海绵组织的分化程度不高，栅栏组织和发达程度不及海绵组织的发达程度高，初步判断其抗旱能力一般。

综上，本研究利用石蜡切片技术和扫描电子显微镜技术对汝城白毛茶叶片的外部特征和内部解剖结构进行观测，初步探究叶片特性与生理活动和环境适应性的相互关系，研究结果可为汝城白毛茶的优良单株选育提供参考，为该品种资源开发利用提供科学依据。根据试验结果，并通过查阅相关的文献资料，初步得出结论：汝城白毛茶成熟叶叶面积平均值为30.1 cm2，属于大叶种；叶形指数平均值为2.8，为长椭圆形。其叶片颜色多为深绿，叶片较大，叶尖较长且多数为急尖，部分为渐尖，叶面微隆起。汝城白毛茶茶树芽叶茸毛茂密、光泽性好、隆起性稍强，说明品质较好。芽头肥壮，茸毛满披，初步判断抗病虫害能力较强。通过观察解剖结构，初步判断其抗旱性一般，抗寒性较强。