食品中金黄色葡萄球菌定量检验能力验证的质量控制

雷兰兰 康婕 王瑛 郑玉红 郭玉凡 张曼

摘 要：能力验证是利用实验室间比对评价实验室校准或检测能力的重要手段，合理的质量控制是确保能力验证检测结果准确性的关键。本文分别从试剂耗材、操作过程、仪器设备、人员及环境等5个方面对食品中金黄色葡萄球菌定量检测能力验证的影响因素和关键环节进行分析，以期为食品微生物实验室能力验证的质量控制提供参考。

关键词：金黄色葡萄球菌;能力验证;质量控制

Quality Control of Proficiency Testing for Quantitative Testing of Staphylococcus aureus in Food

LEI Lanlan， KANG Jie， WANG Ying， ZHENG Yuhong， GUO Yufan， ZHANG Man

（Shaanxi Province Product Quality Supervision and Inspection Institute， Xi’an 710048， China）

Abstract： Proficiency testing is an important method to evaluate laboratory calibration or testing ability by using inter-laboratory comparison. Reasonable quality control is the key to ensure the accuracy of proficiency testing test results. In this paper， the influencing factors and key links of proficiency testing for quantitative detection of Staphylococcus aureus in food are analyzed from five aspects： reagent consumables， operation process， equipment， personnel， and environment， so as to provide reference for the quality control of food microbiology laboratory proficiency testing.

Keywords： Staphylococcus aureus; proficiency testing; quality control

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染，也是常见的食源性致病菌，一旦食物保存不当，金黄色葡萄球菌可大量繁殖，可引起食物中毒。在《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》

（GB 29921—2021）[1]里的13类食品中有8类食品对金黄色葡萄球菌的指标作出了限量要求，《食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》

（GB 31607—2021）[2]的3类食品均对该菌的指标作出了限量要求。

近年来，随着我国对食品安全问题重视程度的增加，对食品检验检测机构的能力要求也越来越高。能力验证（Proficiency Testing）是利用实验室间比对来判定实验室和检查机构能力的活动，也是认可机构加入和维持国际相互承认协议（MRA）的必要条件之一。对于已经获得或者申请CNAS认可的实验室，参加能力验证活动是强制性的，《能力验证领域和频次表》（CNAS-AL07-CNAS）中要求食品微生物领域每年至少参加一次能力验证[3]。作为微生物致病菌指标之一，金黄色葡萄球菌也是食品微生物能力验证考核常见的一个项目。参加者收到的样品一般为白色冻干块状，需要按照作业指导书要求，用一定体积的无菌水或无菌生理盐水再水化后，再按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2016）[4]第2法金黄色葡萄球菌平板计数法进行检验，该检验方法的操作步骤包括样品的水化、系列稀释、接种、培养、典型菌落计数、结果计算以及报告。实验过程中不但包括典型及可疑菌落计数，还包括目标菌的鉴定，在实验过程中有各种细节问题需要注意，因此具有一定的难度。所以为了得到满意的能力验证结果，需要从接到样品到接下来的实验过程中始终贯穿合理的质量

控制。

1 作业指导书

不同于普通食品，为了保证均匀性和稳定性，参加者接收到的能力验证样品一般为冻干粉，并随附一份作业指导书，用于规范检验前后的一些事项操作过程，如样品的保存、水化、检验以及结果报告。因此参加者收到能力验证样品后首先应该仔细研读作业指导书，如果不能及时检验，先将样品按照作业指导书的要求进行冷藏或者冷冻保存，及时按照作业指导书的要求准备水化试剂和检验试剂，检验完成后在规定的时限內按照作业指导书规定的方式进行结果的填报。

2 试剂耗材

2.1 试剂

样品水化及检测过程中用到的培养基等试剂要按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28—2013）[5]，经过生长率、特异性以及选择性的验证，配制好的培养基及试剂要在规定的时间内使用。特别需要注意的是涂布用的Baird-Parker琼脂平板在制备凝固后，应放在超净工作台上，打开皿盖，开启风机，吹风2～

4 h，让平板尽量干燥，加入样液后也才能更好地吸收[6]。不符合标准要求或者使用过期的试剂和培养基等都会导致结果的偏离。

2.2 耗材

金黄色葡萄球菌检验过程中使用的耗材包括无菌袋或者无菌瓶、吸管或者吸头、试管、平皿、涂布棒和接种环等。这些耗材中一次性使用的包括无菌袋、塑料吸管、吸头、平皿、涂布棒及接种环等，在生产过程中已经过化学或者物理方式的消毒灭菌处理，并且在出厂销售前经过消毒剂残留分解的过程，但是检验员在接收到这类耗材时，仍然需要对其进行消毒剂残留抑菌验证以及无菌验证，以防止使用消毒剂残留超标或者非无菌的耗材造成能力验证结果的偏离。对于非一次性耗材，如无菌瓶、玻璃吸管、玻璃试管、玻璃平皿及玻璃涂布棒等，每次使用完成后，应清洗晾干，以备下次使用。使用这类耗材时需要注意的是，在清洗过程中是否使用洗涤剂，清洗过程是否刷洗干净，如果使用洗涤剂之后没有用清水涮洗干净，若存在洗涤剂的残留，在检测过程中会对微生物生长产生抑制作用，导致最终检测结果出现偏离。

3 操作过程

3.1 样品的水化

样品的水化过程应该严格按照作业指导书的要求进行操作，主要过程包括溶解、反复清洗西林瓶及回收清洗液。水化过程是整个检测过程的第一个环节，对最终的检测结果有较大影响，加样品水化所用的稀释剂种类和体积是否正确，样品是否完全溶解水化，水化后的溶液是否完全转移，样品在水化后是否充分混合均匀，样品水化完成后是否立即按照标准要求进行检测等，这些过程中的任何不规范操作都会导致结果的偏离。

3.2 样品的稀释过程

对于液体样品，在稀释过程中，标准要求首先取25 mL样品原液，加入225 mL稀释剂中混合均匀，制成1∶10的样品匀液，再从1∶10的样品匀液中取1 mL注入盛有9 mL稀释剂的试管中混合均匀，制成1∶100的样品匀液，按照上述1+9这样的操作程序继续操作，制成1∶1 000、1∶10 000等10倍系列稀释样品匀液。对于定量检测，系列稀释过程对于检测结果有着非常重要的影响，个别检验员可能认为同样是10倍稀释，在第一次稀释时就直接取1 mL样品原液注于盛有9 mL稀释剂的试管中制成1∶10的样品匀液，但是在检测过程中，取样量越大，代表性也越强，检测结果也越准确，所以取

1 mL样品原液进行系列稀释的非标准操作也会造成结果的偏离。

3.3 样品接种

接种过程是否按照标准要求取1 mL样品匀液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接种量进行加样，涂布过程是否均匀涂布整个平板，涂布过程中涂布棒是否触及平板边缘。加样量错误、涂布不均匀或者涂布时触及平板边缘也会导致结果偏离。

3.4 培养

平板倒置培养前，需要注意平板上的样液是否被完全吸收，如果样液未被完全吸收，倒置后未被吸收的样液可能会流出平板，最终导致计数结果偏低。培养过程中的温度和培养时长是否按照标准进行，不符合要求的培养温度和时长会导致菌落不能正常生长或菌落形态不够典型，从而导致计数结果的偏离。

3.5 典型菌落计数和确认

标准中描述了金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板和血平板上的各种形态特征，要求选择Baird-Parker平板上有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20～200 CFU的平板，计数典型菌落数，从典型菌落中至少选取5个可疑菌落进行鉴定试验。鉴定试验包括染色镜检、血浆凝固酶试验以及血平板培养菌落形态观察。这个过程中包括典型菌落的辨别、计数及鉴定。是否能够正确地识别典型菌落和可疑菌落的形态，是否按照标准要求进行菌落的计数，进行鉴定试验的可疑菌落形态是否具有代表性，染色镜检试验使用的培养物是否新鲜和染色操作步骤是否正确，血浆凝固酶试验是否使用标准菌株进行阳性和阴性对照试验，试验过程中是否在规定的时间内进行观察，观察过程中是否轻拿轻放，血平板上菌落形态的观察是否正确。这个环节也是样品检测过程中重要的一步，尤其是对于加有干扰菌的样品，干扰菌的存在会影响检验员对可疑菌落的辨认和计数，从而造成结果的偏离。

3.6 结果计算和报告

标准中描述了共计5个类别的计数形式和2个计算公式。在这一步中检验员首先需要识别清楚平板计数的结果应该属于5个类别计数形式的哪一种，然后按照该类别的要求使用相应的计算公式进行结果计算，最终按照标准要求报告结果，如果检验员对标准的该部分不能完全理解，则不能正确地选择计数形式和计算公式，从而造成结果的偏离。

4 仪器设备

金黄色葡萄球菌定量检验过程中使用的关键设备主要有高压灭菌锅、生化培养箱、干热灭菌箱，这3种设备都属于温控设备，需要对其进行温度的准确性、稳定性和均匀性的设备性能验证，不符合标准要求的设备。例如高压灭菌锅可能会造成锅内培养基等试剂的过度灭菌或者灭菌不充分，不符合要求的生化培养箱则会造成箱内培养的微生物不能正常生长，不符合要求的干热灭菌箱也会造成箱内的器皿灭菌不够充分或者对器皿造成破坏，最终造成结果出现偏离。

5 人员

从事微生物检验的人员应该具有相应的微生物专业教育或培训经历，具备相应的资质，能够理解并正确实施检验。无相应检验资质或者能力經验欠缺的人员可能对作业指导书以及检验标准理解不够充分，从而在样品水化、系列稀释、接种、培养、计数确认及计算结果报告等过程中出现不规范操作，从而造成结果的偏离。

6 环境

金黄色葡萄球菌属于致病菌，而能力验证定量检验样品中含有大量的活菌，因此实验中涉及活菌操作的过程应该在二级生物安全实验室进行，以防对样品、实验人员以及环境产生危害。

7 结语

影响金黄色葡萄球菌定量检验能力验证结果准确性的因素主要有人员、设备、试剂、环境条件、样品前处理和所采用的方法等。因此，在整个实验过程中需按照作业指导书和检验标准的要求，严格控制实验条件，保证使用的仪器处于良好的工作状态，使用的培养基等试剂通过验证，以及检测人员具备相应的能力等，保证能力验证工作获得满意的考核结果。

参考文献

[1]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会和国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量：GB 29921—2021[S].北京：中国标准出版社，2021.

[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会和国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量：GB 31607—2021[S].北京：中国标准出版社，2021.

[3]陈欢.谈谈参加食品微生物学能力验证的体会[J].中国卫生检验杂志，2009，19（2）：441-442.

[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品微生物检验 金黄色葡萄球菌检验：GB 4789.10—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[5]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品微生物检验 培养基和试剂的质量要求：GB 4789.28—2013[S].北京：中国标准出版社，2013.

[6]雷兰兰.食品微生物能力验证的重要因素[J].现代食品，2018（12）：4-6.

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