miR-3177-3p通过TLR4对香烟烟雾提取物诱导支气管上皮细胞凋亡的影响

罗荣荣 吴震 邵伯云

慢性阻塞性肺疾病是常见的呼吸系统疾病，其与香烟烟雾有关，香烟烟雾中含有很多种有害物质，可以促进支气管上皮细胞损伤[1]。支气管上皮细胞有十分广泛的生理功能，也是保护气道组织的第一道屏障，支气管上皮细胞在损伤修复、生物代谢、抗原递呈、氧化应激等过程中发挥作用[2]。支气管上皮细胞是慢性阻塞性肺疾病的重要靶细胞之一，其损伤发生与细胞内多个基因的表达有关[3]。miRNA是一类没有编码功能的小分子RNA，其有很多生物学作用，对细胞分化、凋亡、代谢、氧化平衡等均有调控功能[4]。研究表明，miRNA参与慢性阻塞性肺疾病发生，与支气管上皮细胞损伤有关[5]。既往研究证实，miR-3177-3p在慢性阻塞性肺疾病中表达下调，并且随着疾病严重程度的增加，miR-3177-3p表达水平越低[6]。TLR4是一个多功能调控因子，在细胞凋亡、氧化应激等过程中发挥作用[7]。目前已知TLR4在CSE诱导的支气管上皮细胞损伤中过度激活，并且下调TLR4抑制支气管上皮细胞凋亡[8]。本实验研究miR-3177-3p通过TLR4对CSE诱导的支气管上皮细胞凋亡的影响，为靶向基因改善慢性阻塞性肺疾病提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料 支气管上皮细胞16HBE购自上海美轩生物科技有限公司；mimics control、miR-3177-3p mimics、pcDNA-TLR4、pcDNA均由北京吉田生物科技有限公司合成构建；Bax抗体、Bcl-2抗体购自美国Abgent；TLR4抗体购自齐一生物科技(上海)有限公司；GSH-Px检测试剂盒购自上海超研生物科技有限公司；MDA检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；SOD检测试剂盒购自北京博迈斯科技发展有限公司。

1.2 CSE的制备方法[9]将已经去掉过滤嘴后的2支香烟于超净工作台中点燃，燃烧10 min，抽取的烟雾溶解在体积为50 μl的DMEM/F12中，充分摇匀，然后添加NaOH将pH值调整为7.4，经过0.22 μm的微孔过滤以后，即为浓度为100%的CSE溶液，在实验时需要用DMEM/F12将CSE稀释为10%。

1.3 实验分组 支气管上皮细胞在含有100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素、10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养，条件：37℃，饱和湿度，5% CO2、95%空气。支气管上皮细胞分成Control组、CSE组、CSE+miR-NC组、CSE+miR-3177-3p组，CSE组、CSE+miR-NC组、CSE+miR-3177-3p组细胞在实验0 h时，用含有CSE体积分数为10%的细胞培养液培养；CSE+miR-NC组、CSE+miR-3177-3p组细胞在实验开始前12 h，分别转染mimics control、miR-3177-3p mimics，细胞转染方法参照转染试剂Lipofectamine 2000进行。

1.4 miR-3177-3p表达检测 应用Realtime PCR方法检测miR-3177-3p的表达。Control组、CSE组、CSE+miR-NC组、CSE+miR-3177-3p组按照上述分组方法培养处理24 h以后，将细胞培养液上清弃掉，然后加入0.25%的胰蛋白酶消化，收集细胞，取Trizol试剂将细胞裂解，按照常规步骤分别提取各细胞内的总RNA。取200 μg的RNA，添加2 μl的5×gDNA Eraser Buffer、1 μl的gDNA Eraser，最后加RNase free H2O至体积为10 μl，充分混合。然后在上述体系内分别依次添加3 μl的miRNA RT Primer、1 μl的PrimerScript RT Enzyme Mix I、4 μl的5×Prime Script Buffer，最后加入RNase free H2O补足到20 μl，将反应体系放在37℃结合15 min，85℃结合5 s，合成的cDNA放在-20℃保存。然后取cDNA，按照下述方法制备PCR体系，PCR体系包含：0.4 μl的上游和下游引物、10 μl的SYBR Primer Ex Taq、1 μl的cDNA模板，最后添加ddH2O补足20 μl，将PCR仪的反应程序调整为：预变性(95℃ 30 s)；变性(95℃ 5 s)；退火(60℃ 20 s)，一共设置40个循环。然后根据反应中的Ct值，以2-△△Ct方法计算miR-3177-3p的表达，U6作为内参。

1.5 细胞凋亡检测 4组按照上述分组方法培养处理24 h后，将细胞培养液上清弃掉，然后加入0.25%的胰蛋白酶消化，收集细胞，在细胞内分别添加PBS溶液将细胞洗涤2次，最后在细胞内添加体积为500 μl 的结合缓冲液，然后添加5 μl的Annexin V-FITC染色液，放在避光条件下孵育20 min，然后再添加5 μl的PI染色液，避光结合15 min。立即用流式细胞仪检测4组细胞凋亡情况。

1.6 Bax、Bcl-2、TLR4蛋白表达检测 应用Western blot方法测定Bax、Bcl-2、TLR4蛋白水平。Control组、CSE组、CSE+miR-NC组、CSE+miR-3177-3p组按照上述分组方法培养处理24 h后，将细胞培养液上清弃掉，然后加入0.25%的胰蛋白酶消化，收集细胞，分别添加PBS溶液将细胞洗涤2次，添加RIPA裂解溶液，放在冰上充分裂解10 min。将裂解溶液按照4℃，12 000 g离心10 min，蛋白在上清中。吸取适量的蛋白，按照BCA方法分别检测提取的蛋白样品的浓度，然后添加5×Loading Buffer，置于100℃条件下煮沸5 min。按照常规步骤分别制备10%的分离胶以及5%的浓缩胶。在每个上样孔中按照30 μg蛋白样品上样。电泳仪的电压设置为80 V，30 min以后溴酚蓝染料即将进入分离胶，然后将电泳仪的电压设置为100 V，2 h以后溴酚蓝染料跑到凝胶的底部。取出凝胶，与NC膜共同浸泡在转移缓冲液中。设置60 V电压、4℃条件下转膜1 h。将NC膜取出，浸泡在含有5%脱脂奶粉的封闭液平皿内把非特异性的位点封闭；TBST溶液洗涤3次。NC膜放在添加有一抗稀释液的平皿内，4℃孵育过夜，TBST溶液洗涤3次。最后将NC膜置于含有二抗稀释液的平皿内，37℃环境中结合1 h。按照ECL方法显色。分析条带的灰度值。内参为GAPDH。Bax/Bcl-2/TLR4蛋白水平=Bax/Bcl-2/TLR4条带灰度值÷GAPDH灰度值。

1.7 MDA、SOD、GSH-Px水平检测 Control组、CSE组、CSE+miR-NC组、CSE+miR-3177-3p组按照上述分组方法培养处理24 h以后，将上清溶液弃掉，收集细胞，用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，用黄嘌呤氧化法检测SOD水平，用比色法检测GSH-Px水平，具体操作步骤按照MDA检测试剂盒、SOD检测试剂盒、GSH-Px检测试剂盒说明书进行。

1.8 pcDNA-TLR4对miR-3177-3p影响细胞作用的检测 分别将miR-3177-3p mimics、pcDNA和miR-3177-3p mimics、pcDNA-TLR4共转染到支气管上皮细胞中，然后用含有CSE体积分数为10%的细胞培养液培养，记为CSE+miR-3177-3p+pcDNA组和CSE+miR-3177-3p+pcDNA-TLR4组，细胞培养24 h以后，按照1.4、1.5、1.6中方法分别检测细胞凋亡和Bax、Bcl-2、TLR4蛋白表达水平以及MDA、SOD、GSH-Px水平。

2 结果

2.1 miR-3177-3p mimcis对CSE诱导的支气管上皮细胞中miR-3177-3p表达影响 与Control组比较，CSE组支气管上皮细胞中miR-3177-3p表达水平降低(P<0.05)；与CSE+miR-NC组比较，CSE+miR-3177-3p组支气管上皮细胞中miR-3177-3p表达水平升高(P<0.05)。miR-3177-3p mimcis上调CSE诱导的支气管上皮细胞中miR-3177-3p表达水平。见表1。

表1 miR-3177-3p mimcis转染后CSE诱导的支气管上皮细胞中miR-3177-3p表达水平

2.2 miR-3177-3p mimcis对CSE诱导的支气管上皮细胞凋亡影响 与Control组比较，CSE组支气管上皮细胞凋亡率升高，细胞中Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)；与CSE+miR-NC组比较，CSE+miR-3177-3p组支气管上皮细胞凋亡率降低，细胞中Bax蛋白表达水平降低，Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05)。上调miR-3177-3p抑制CSE诱导的支气管上皮细胞凋亡。见图1，表2。

图1 miR-3177-3p对CSE诱导的支气管上皮细胞凋亡影响;A 流式细胞术检测支气管上皮细胞凋亡结果；B Western blot检测支气管上皮细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达结果

表2 miR-3177-3p mimcis转染后CSE诱导的支气管上皮细胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平

2.3 miR-3177-3p mimcis对CSE诱导的支气管上皮细胞氧化损伤的影响 与Control组比较，CSE组支气管上皮细胞MDA水平升高，细胞SOD、GSH-Px水平降低(P<0.05)；与CSE+miR-NC组比较，CSE+miR-3177-3p组支气管上皮细胞MDA水平降低，细胞SOD、GSH-Px水平升高(P<0.05)。上调miR-3177-3p抑制CSE诱导的支气管上皮细胞氧化损伤。见表3。

表3 miR-3177-3p mimcis转染后CSE诱导的支气管上皮细胞MDA、SOD、GSH-Px水平

2.4 miR-3177-3p mimcis对CSE诱导的支气管上皮细胞中TLR4表达影响 与Control组比较，CSE组支气管上皮细胞中TLR4蛋白表达水平升高(P<0.05)；与CSE+miR-NC组比较，CSE+miR-3177-3p组支气管上皮细胞中TLR4蛋白表达水平降低。上调miR-3177-3p抑制CSE诱导的支气管上皮细胞中TLR4蛋白表达。见图2，表4。

图2 Western blot方法检测miR-3177-3p mimcis转染后CSE诱导的支气管上皮细胞中TLR4蛋白表达

表4 miR-3177-3p mimcis转染后CSE诱导的支气管上皮细胞TLR4蛋白水平

2.5 pcDNA-TLR4对支气管上皮细胞中TLR4蛋白表达影响 与CSE+miR-3177-3p+pcDNA组比较，CSE+miR-3177-3p+pcDNA-TLR4组支气管上皮细胞TLR4蛋白水平升高(P<0.05)。pcDNA-TLR4上调支气管上皮细胞中TLR4蛋白表达水平。见图3，表5。

表5 miR-3177-3p mimcis、pcDNA-TLR4转染后CSE诱导的支气管上皮细胞TLR4蛋白水平

图3 Western blot方法检测miR-3177-3p mimcis、pcDNA-TLR4转染后CSE诱导的支气管上皮细胞中TLR4蛋白表达

2.6 上调TLR4逆转miR-3177-3p对支气管上皮细胞凋亡和氧化损伤的作用 与CSE+miR-3177-3p+pcDNA组比较，CSE+miR-3177-3p+pcDNA-TLR4组支气管上皮细胞凋亡率升高，细胞中Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平降低(P<0.05)。上调TLR4逆转miR-3177-3p对支气管上皮细胞凋亡和氧化损伤的作用。见图4，表6。

图4 miR-3177-3p mimcis、pcDNA-TLR4转染对CSE诱导的支气管上皮细胞凋亡影响；A 流式细胞术检测支气管上皮细胞凋亡结果；B Western blot检测支气管上皮细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达结果

表6 miR-3177-3p mimcis转染后CSE诱导的支气管上皮细胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平以及MDA、SOD、GSH-Px水平

3 讨论

miRNA有很多生物学功能，已经发现其在不同类型的细胞分化、凋亡等过程中发挥重要调节功能，并且miRNA还通过影响细胞生物学行为参与疾病的进展[4]。miRNA没有编码蛋白质的作用，其可以通过影响下游基因或信号通路的转导发挥多重功能[10]。已知miRNA在哮喘、肺肿瘤等呼吸系统疾病中发挥作用，并且miRNA还可能是疾病治疗的靶点[11]。在慢性阻塞性肺疾病中发现miRNA参与支气管上皮细胞损伤过程，其表达改变与细胞凋亡水平有关[12]。有研究发现，miR-3177-3p在慢性阻塞性肺疾病中表达下调，且miR-3177-3p随着疾病严重程度的升高而降低[6]。本结果表明，CSE诱导的支气管上皮细胞中miR-3177-3p表达水平降低，并且上调miR-3177-3p抑制CSE诱导的支气管上皮细胞凋亡，这可能提示，miR-3177-3p在慢性阻塞性肺疾病中发挥保护功能。

慢性阻塞性肺疾病发生时，支气管上皮细胞内的氧自由基水平异常升高是导致细胞凋亡水平增加，造成肺组织完整结构被破坏的重要原因[13]。正常情况下，细胞内氧自由基的水平处于动态平衡的状态，细胞内产生的氧自由基能够被抗氧化酶降解，使细胞处于低剂量氧自由基状态，这些氧自由基参与信号转导、维持氧化平衡[14]。当细胞受到外界因素刺激后，抗氧化酶的活性降低，细胞内氧自由基水平异常升高，导致存在于细胞内的脂质被氧化，造成氧化损伤[15]。MDA是脂质发生过氧化的产物[16]。SOD、GSH-Px分别为细胞内的主要抗氧化酶，其活性的高低与氧自由基水平有直接关系[17]。有报道表明，过量的氧自由基不仅可以造成氧化损伤，还可以激活细胞凋亡途径，诱导细胞凋亡[18]。Bcl-2是与细胞凋亡关系密切的蛋白家族，其含有多个成员，根据其在细胞凋亡过程中的作用，蛋白成员分成促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，Bax是一种促凋亡蛋白，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，二者表达改变共同调控细胞凋亡进程[19]。结果显示，上调miR-3177-3p抑制CSE诱导的支气管上皮细胞中Bax蛋白表达，促进Bcl-2蛋白表达，上调细胞中SOD、GSH-Px水平，下调MDA水平，提示上调miR-3177-3p可能通过改善支气管上皮细胞氧化损伤而抑制细胞凋亡。

TLR4是Toll受体家族，其可以识别相关病原体而激活下游信号通路转导，进而参与生命机体进程[21,22]。TLR4参与组织修复、细胞生长、细胞凋亡、能量代谢等过程，是一个具有十分广泛作用的调节因子[22-24]。以前的实验结果发现，TLR4在慢性阻塞性肺疾病中过度表达，且下调TLR4抑制CSE诱导的支气管上皮细胞损伤[8]。本实验发现，上调miR-3177-3p抑制CSE诱导的支气管上皮细胞中TLR4蛋白表达，并且上调TLR4能够逆转miR-3177-3p对支气管上皮细胞凋亡和氧化损伤的作用，提示上调miR-3177-3p可能通过TLR4参与支气管上皮细胞损伤。

综上所述，miR-3177-3p可能是慢性阻塞性肺疾病保护因子，可以抑制CSE诱导的支气管上皮细胞凋亡和氧化损伤，并且其机制可能与TLR4有关。