肿瘤蛋白D52在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

王振勇，孟宇，李金超，张雷，石亮，田亮，刘汝海

（河北省沧州市中心医院，河北 沧州 061000，1.肝胆胰外一科，2.病理科）

胰腺癌早期诊断困难，大部分患者确诊时已发展到癌症晚期，且现有治疗手段效果欠佳。为改善胰腺癌治疗效果，寻找与胰腺癌相关的癌基因并对其机制进行研究，显得尤为重要。肿瘤蛋白D52（tumor protein D52，TPD52）在富含分泌颗粒的分泌器官（如胃、胰腺、睾丸及乳腺等）中参与Ca2+依赖型消化酶分泌的调节[1]。目前TPD52参与肿瘤发生、发展及其分子机制受到广泛关注[2-3]，是近年来被发现的一类原癌基因。关于TPD52表达与胰腺癌关系的研究报道尚少。本研究旨在探讨TPD52在胰腺癌组织中的表达及其临床意义。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集自2015年6 月至2020 年6 月于河北省沧州市中心医院接受根治性手术治疗并病理确诊的129例胰腺导管腺癌患者石蜡包埋组织标本。所有患者术前均未接受放、化疗或其他抗肿瘤治疗。收集患者性别、年龄、肿瘤部位及直径、淋巴结转移、肝转移、美国肿瘤联合委员会（AJCC）第8版分期、门静脉侵犯等临床病理资料。患者年龄38～81岁，中位年龄61岁。通过电话或门诊随访，随访时间为手术之日起至死亡或末次随访时间，截止时间2021 年7月30日。

1.2 免疫组织化学分析

将石蜡包埋的组织连续切片，65 ℃烤片过夜，进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后于磷酸盐缓冲液（PBS）中浸洗3次，每次5 min。使用柠檬酸抗原修复液进行抗原修复，PBS冲洗3次。3% H2O2室温孵育15 min，PBS冲洗3次，滴加山羊血清，室温孵育15 min，再次PBS冲洗3次。滴加一抗（TPD52兔抗人多克隆抗体，1∶100稀释），湿盒内4 ℃过夜，次日PBS冲洗3次；加辣根过氧化物酶标记二抗（羊抗兔IgG抗体，1∶500稀释），37 ℃孵育60 min，PBS冲洗3次。二氨基联苯胺液显色，苏木素复染，中性树胶封固。于显微镜下观察。

1.3 免疫组织化学结果判定

由两名病理科医师阅片，高倍镜（×400）下随机选取5 个不同视野，按阳性细胞所占的百分比计分：≤5%为0 分，＞5%且≤25%为1 分，＞25%且≤50%为2分，＞50%为3分。根据染色强弱程度计分：无染色0 分；出现淡黄色颗粒为1 分；出现浅棕黄色颗粒为2 分；出现大量深棕黄色的颗粒为3 分。最终根据两者的乘积确定该组织标本的免疫组化评分值：0～3 分为低表达，4～9 分为高表达。将组织标本分为低表达组、高表达组，进行统计学处理。

1.4 统计学分析

应用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，Graph-Pad Prism 5绘制生存曲线。计数资料比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。生存曲线分析采用Kaplan-Meier法，Log-rank测验比较两组的不同趋势。单因素及多因素生存分析采用Cox风险回归模型。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌组织与癌旁组织TPD52的表达

TPD52在胰腺癌及癌旁组织中的表达主要定位于细胞浆及细胞膜中，呈清晰棕色或棕褐色（见图1）。64.3%（83/129）胰腺癌组织中TPD52高表达，而仅34.9%（45/129）癌旁正常组织中TPD52高表达，两组间差异有统计学意义（χ2=22.389，P＜0.001）。

图1 胰腺癌及癌旁组织中TPD52的表达（免疫组织化学，×100）

2.2 TPD52表达与胰腺癌患者临床病理特征的关系

胰腺癌组织中TPD52 的高表达与患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、淋巴结转移、肝转移及门静脉侵犯无明显相关（P＞0.05），但与患者的TNM分期、神经浸润及组织分化程度明显相关（P＜0.05）。III～IV期胰腺组织中TPD52高表达的比例显著高于I～II期（χ2=4.178，P=0.041）。存在神经侵犯组TPD52的高表达率高于无神经侵犯组，其差异有统计学意义（χ2=8.499，P=0.004）。不同分化程度组的TPD52 高表达率差异有统计学意义（χ2=12.262，P=0.002），见表1。

表1 胰腺癌组织TPD52表达与患者临床病理特征之间的关系（例）

2.3 TPD52表达与胰腺癌患者无病生存时间（disease free survival，DFS）的关系

Kaplan-Merier生存分析显示，中位无病生存时间（mDFS）为11.8个月，其中TPD52高表达者mDFS为8.3个月，TPD52低表达者mDFS为18.7个月，两组间差异有统计学意义（Log-rankχ2=11.460，P=0.001），见图2。多因素Cox比例风险模型显示，淋巴结转移（HR1.931，95%CI1.233～3.025，P=0.004）、组织分化程度（HR2.148，95%CI1.144～4.035，P=0.017）、门静脉侵犯（HR2.026，95%CI1.020～4.025，P=0.044）及TPD52高表达（HR1.696，95%CI1.130～2.545，P=0.011）是影响胰腺癌患者术后DFS的独立危险因素（见表2）。

表2 Cox回归分析影响胰腺癌患者术后DFS的因素

图2 Kaplan-Meier无病生存曲线

2.4 TPD52表达与胰腺癌患者总生存时间（overall survival，OS）的关系

Kaplan-Merier生存分析显示，中位总生存时间（mOS）为20.9 个月，其中TPD52 高表达者mOS为16.6 个月，TPD52 低表达者mOS为24.6 个月，两组间差异有统计学意义（Log-rankχ2=11.450，P=0.001，生存曲线见图3。多因素Cox比例风险模型显示，淋巴结转移（HR1.711，95%CI1.099～2.665，P=0.017）、肝转移（HR2.987，95%CI1.141～7.821，P=0.026）及TPD52高表达（HR1.656，95%CI1.100～2.492，P=0.016）是影响胰腺癌患者术后OS的独立危险因素（见表3）。

表3 Cox回归分析影响胰腺癌患者术后OS的因素

图3 Kaplan-Meier总生存曲线

3 讨论

人类肿瘤蛋白D52（human tumor protein D52，hTPD52）是Byrne在研究乳腺癌中首次发现，编码hTPD52 的基因位于人类染色体8q21.13[4]，其家族成员包括TPD52、TPD52L1、TPD52L2和TPD52L3四种蛋白。TPD52 能够促进肿瘤的增殖、侵袭与转移，同时抑制DNA修复和肿瘤细胞凋亡。另外，在TPD52诱导下机体可以产生对肿瘤有保护作用的免疫反应[5]，其产生的自身抗体，可能成为一个潜在的分子治疗靶标[6]。

大量研究发现TPD52 在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌以及血液系统恶性肿瘤等疾病中通过基因扩增来提高其表达水平，调控细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为，进而导致恶性肿瘤的发生，并与淋巴结转移、肿瘤晚期阶段等相关[7-11]。我们前期研究中，体外实验发现抑制TPD52表达可明显抑制胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，导致细胞周期阻滞，并促进细胞凋亡[12]。本研究从临床层次出发，通过免疫组化染色显示，胰腺癌组织中TPD52的表达明显高于癌旁正常组织。TNM分期晚和存在神经侵犯的胰腺癌患者，TPD52 表达水平高，表明TPD52表达水平与肿瘤进展程度相关。在分化程度较低的病理组织中TPD52的阳性表达率显著高于分化程度较高的病理组织，提示TPD52表达水平与肿瘤的恶性程度有关。

传统肿瘤标志物对胰腺癌的诊断缺乏特异性和敏感性，且预后及疗效评价指标的缺乏，导致无法选择最适合的辅助疗法延长患者生存时间[13]。因此，寻找新的更加特异胰腺癌预后指标有利于显著改变胰腺癌预后不良的现状。根据生存曲线结果，TPD52 表达与胰腺癌患者术后DFS及OS相关，TPD52 高表达患者术后DFS及OS均较短。多因素Cox比例风险模型分析显示，TPD52 高表达是影响胰腺癌患者术后DFS及OS独立危险因素。因此，本研究认为TPD52表达与胰腺癌患者的预后存在相关性。TPD52 高表达预示着肿瘤恶性程度高、病情严重，预后差；而TPD52 低表达患者的生存时间长，预后较好。

胰腺癌的生物学行为是涉及多步骤、多基因、多信号通路的复杂过程。研究胰腺癌发生、发展过程中的基因改变及其相互关系，进而对关键分子加以干预，有希望能够影响肿瘤的发生、发展，甚至达到治愈肿瘤的目的。Yin等[14]发现microRNA-449b-5p通过靶向TPD52抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭；Zhang等[15]发现敲低TPD52可以显著减轻microRNA-449过表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭以及E-钙黏着蛋白，N-钙黏着蛋白和波形蛋白的表达的影响。但TPD52在胰腺癌发生发展中的上下游调控机制尚不清楚，需要进一步研究。

本研究结果证实TPD52在胰腺癌组织中存在高表达，可能是胰腺癌患者预后不良的一个重要预测指标，其在临床中的其他作用及机制尚待进一步探索。