C5orf66-AS1对直肠癌细胞增殖、侵袭及Wnt/β-catenin通路的影响

谷敬锋，刘海霞，王桂琦，张 建，邢东洋，马建伟

(河北医科大学第一医院 外科,河北 石家庄 050011)

直肠癌是一种强侵袭性且发于肠道的恶性肿瘤，在全球所有类型的癌症中，发病率居第三，死亡率居第二[1]。在我国，预计每年在结肠癌和直肠癌新发现的病例超过38万[2]。因此，寻找治疗直肠癌的新策略具有重要意义。长链非编码RNA(Long noncoding RNAs，lncRNAs)是一类特殊的RNA分子，其长度超过200个核苷酸，但其并无蛋白编码的能力。lncRNAs作为多种疾病的表观遗传调控因子，广泛参与了多种生物学过程[3]，如介导DNA与蛋白质的相互作用、吸附microRNAs以及作为诱饵与蛋白质结合等[4-6]。越来越多的证据表明，正如癌基因影响患者的预后一样[7]，一些lncRNAs也影响癌细胞的发生发展，提示lncRNAs可能成为靶向治疗直肠癌的新途径[8]。文献报道，lncRNA C5orf66-AS1在胃癌[9]、宫颈癌[10]以及口腔鳞癌[11]等多种肿瘤细胞中异常表达，可参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等多个生物学过程。本研究通过检测C5orf66-AS1在不同直肠癌细胞株中的表达以及siRNA干扰抑制C5orf66-AS1的表达后观察直肠癌细胞的增殖、凋亡及侵袭过程，并初步探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 直肠癌细胞株SW837、SW1463、HR-8348、COLO741及人正常直肠粘膜上皮细胞(ATCC-0034)均购自美国ATCC中心；胎牛血清、DEME培养基以及0.25%胰蛋白酶购自北京百克赛斯；LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；RNA提取试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购自北京天根公司；CCK-8细胞增殖试剂盒和Annexin V-FITC/PI试剂盒均购自日本DOJINDO公司；Transwell小室(24孔，孔径8μm)购自美国CONRING公司；基质胶购自美国BD Biocoat公司；一抗β-catenin、PCNA、Vimentin、Caspase-3及GAPDH均购自英国Abcam公司；细胞培养箱、酶标仪及流式细胞仪均购自美国Thermo Scientific(型号：BB150-2TCS、MK3、Life Attune)；荧光定量PCR仪、凝胶成像仪均购自美国BIO-RAD(型号：CFX96、Gel Doc EZ)；倒置荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司(型号：IX71)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 直肠癌细胞株SW837、SW1463、HR-8348、COLO741及人正常直肠粘膜上皮细胞采用DEME培养基(含10%胎牛血清)在37℃恒温培养箱中培养，待细胞繁殖达到培养瓶的90%以上，以1∶3的比例传代培养，细胞传代培养大于2次，选取生长状态良好且无污染的细胞用于后续实验研究。

1.2.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同细胞中C5orf66-AS1表达 收集培养的SW837、SW1463、HR-8348、COLO741细胞和人正常直肠粘膜上皮细胞，按照RNA提取试剂盒方法提取不同细胞的总RNA，经反转录得到cDNA，最后对cDNA样品进行qRT-PCR检测，qRT-PCR程序为：95℃5 min；94℃30 s，53℃ 30 s，72℃ 2min，38个循环。采用2-ΔΔCt计算C5orf66-AS1的相对表达量。

引物序列：C5orf66-AS1-F为5′-CGGGATCAACCCTCTGCTTT-3′，C5orf66-AS1-R为5′-TTCTTGAGAAGCGACTGCGT-3′；GAPDH-F为5′-TGAC-TTCAACAGCGACACCCA-3′，GAPDH-R为5′-TG-AGCGATGTGGCTCGGCT-3′。

1.2.3 细胞转染及分组 根据NCBI中GeneBank中提供的C5orf66-AS1基因的核苷酸序列由上海吉玛公司设计并合成沉默C5orf66-AS1的引物。

选择对数期生长的SW837细胞接种在6孔细胞培养板中，待细胞生长达到培养瓶的80%以上时，将细胞分为5组，依次为正常对照组(未被转染)、阴性对照组、siRNA沉默C5orf66-AS1-1、-2、-3组，依次作为NC组、si-NC组、si-C5orf66-AS1-1组、si-C5orf66-AS1-2组、si-C5orf66-AS1-3组。按照LipofectamineTM2000说明书操作方法，正常对照组不转染，其他4组分别转染si-NC、si-C5orf66-AS1-1、si-C5orf66-AS1-2、si-C5orf66-AS1-3。转染后各组细胞先在无血清培养基中培养6～8 h，后更换为正常培养基继续培养48 h，进行后续实验。qRT-PCR验证C5orf66-AS1的沉默效率，具体操作方法参考1.2.2。

1.2.4 CCK-8检测SW837细胞增殖活性 将处于对数期生长的SW837细胞，添加胰蛋白酶消化，后接种于96孔细胞培养板中，细胞培养过夜后瞬时转染(分别不转染、转染si-NC、转染si-C5orf66-AS1-3)，分别在24、48、72 h后消化终止培养，加入CCK-8溶液在37℃培养箱中避光孵育2 h，最后采用酶标仪测定各孔细胞在450 nm波长处的吸光度值(A)，以A值表示各组细胞的增殖活性。

1.2.5 流式细胞仪检测SW837细胞的凋亡率 收集转染后的各组SW837细胞，先使用PBS漂洗3次，后添加Binding Buffer(100 μL)制备悬浮液，依次添加5 μL AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)溶液，室温黑暗孵育20 min，最后通过流式细胞仪检测SW837细胞的凋亡率。

1.2.6 Transwell法检测SW837细胞的侵袭能力 在实验开始前先使用无血清的培养基稀释Metrigel基质胶，后加入到Transwell上室并干燥备用。收集各组SW837细胞，制备形成悬浮液后添加至Transwell上室(含干燥Metrigel基质胶)，下室中加入正常培养基(含血清)作为诱导剂，正常培养48 h后，用棉签轻轻去除上室残留的细胞后添加95%甲醇固定细胞20 min，使用PBS清洗3遍后用棉签吸干，添加0.5%结晶紫染色，在倒置显微镜中拍照并观察穿膜的细胞数，图像放大200倍。

1.2.7 Western blot实验检测SW837细胞中β-catenin、PCNA、Vimentin、Caspase-3蛋白表达 收集转染后的各组细胞，添加适当的RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法检测样品蛋白的浓度及质量。取适量的蛋白样品添加缓冲液变性后，每孔点样25 μL，蛋白胶分离蛋白，随后通过湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉封闭后，添加一抗(β-catenin、PCNA、Vimentin、Caspase-3以及内参GAPDH)于摇床中4℃孵育过夜，隔天添加预冷的PBS冲洗3次后，添加提前稀释(1∶5 000)的二抗室温摇床孵育2 h，再用PBS冲洗3次，添加ECL化学发光混合液，于凝胶成像仪中观察拍照。使用Image J软件计算各蛋白的灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白的灰度值。

2 结果

2.1 C5orf66-AS1在直肠癌细胞株中的表达 将人正常直肠粘膜上皮细胞作为对照细胞，qRT-PCR检测发现，C5orf66-AS1 mRNA表达水平在直肠癌细胞SW837、SW1463、HR-8348、COLO741中(3.72±0.11、2.36±0.24、2.45±0.19、1.96±0.13)的表达水平显著高于人正常直肠粘膜上皮细胞(1.01±0.05，F=228.966，P<0.05)，其中在SW837中表达水平最高，故后续研究以SW837细胞为直肠癌细胞载体。

2.2 C5orf66-AS1沉默效率检测 分别使用si-C5orf66-AS1-1、si-C5orf66-AS1-2、si-C5orf66-AS1-3侵染SW837细胞，si-C5orf66-AS1-1、si-C5orf66-AS1-2、si-C5orf66-AS1-3组C5orf66-AS1相对表达水平(0.68±0.10、0.43±0.05、0.19±0.02)显著低于NC组和si-NC组(0.98±0.13和1.05±0.16，F=71.551，P<0.05)，NC组和si-NC组差异无统计学意义(P>0.05)。其中si-C5orf66-AS1-3组细胞中C5orf66-AS1表达最低，故其沉默效率最高，后续将以此组细胞继续进行后续实验。

2.3 沉默C5orf66-AS1对SW837增殖活性的影响 CCK-8结果显示(见表1)，在SW837细胞培养24～72 h内，si-NC组与NC组细胞增殖活性无明显差异(P>0.05)；SW837细胞培养24 h时，与si-NC组相比，si-C5orf66-AS1-3组细胞增殖活性无明显差异(P>0.05)，而在细胞培养48、72 h时，si-C5orf66-AS1-3组SW837细胞增殖活性明显降低(P<0.05)。

表1 沉默C5orf66-AS1对SW837细胞增殖活性的影响(A值，

在NC组和si-NC组中，在SW837细胞培养24～72 h内，细胞增殖活力随着培养时间的延长而增高，差异有统计学意义(P<0.05)。在si-C5orf 66-AS1-3组中，SW837细胞培养48 h后细胞增殖活力明显高于24 h(P<0.05)，而72 h与48 h细胞增殖活力则无明显变化(P>0.05)。故后续实验培养细胞均培养48 h。

2.4 沉默C5orf66-AS1对SW837细胞凋亡率的影响 流式细胞仪结果显示(见图1)，3组间SW837细胞凋亡率差异有统计学意义(F=16.581，P<0.05)，其中NC组SW837细胞凋亡率与si-NC组无明显差异[(6.34±1.06)%比(7.05±1.14)%，P>0.05]；而si-C5orf66-AS1-3组SW837细胞凋亡率显著高于si-NC组[(18.45±2.94)%比(7.05±1.14)%，P<0.05]。

A：NC组；B：si-NC组；C：si-C5orf66-AS1-3组。图1 流式细胞仪检测SW837细胞的凋亡率

2.5 沉默C5orf66-AS1对SW837细胞侵袭的影响 Transwell小室结果显示(见图2)，3组间SW837细胞侵袭数差异有统计学意义(F=314.119，P<0.05)，其中与si-NC组相比，NC组穿膜细胞数无明显差异(204.51±8.53比196.56±7.39，P>0.05)；而si-C5orf66-AS1-3组细胞穿膜数显著降低(114.34±3.93比196.56±7.39，P<0.05)。

A：NC组；B：si-NC组；C：si-C5orf66-AS1-3组。图2 倒置显微镜下观察SW837细胞侵袭情况(结晶紫染色，200×)

2.6 沉默C5orf66-AS1对Wnt/β-catenin信号通路的影响 Western blot检测发现(见表2、图3)，3组间SW837细胞中β-catenin、PCNA、Caspase-3和Vimentin蛋白相对表达量差异有统计学意义(F=18.395、20.513、13.089、22.450，P<0.05)，其中与si-NC组相比，NC组SW837细胞中β-catenin、PCNA、Caspase-3和Vimentin蛋白相对表达量无明显差异(P>0.05)；而si-C5orf66-AS1-3组SW837细胞中β-catenin、PCNA和Vimentin蛋白表达量显著降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白表达量显著增高(P<0.05)。

图3 各组SW837细胞中β-catenin、PCNA、Caspase-3和Vimentin蛋白相对表达量

表2 沉默C5orf66-AS1对SW837细胞中β-catenin、PCNA、Caspase-3和Vimentin蛋白表达的影响

3 讨论

直肠癌是一种消化道常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率逐年增高，因其确诊时即为中晚期，严重影响人类健康[12]。已有研究表明，癌基因和抑癌基因的失调是肿瘤发生发展的重要因素[13]。已有研究报道lncRNAs具有复杂的生物学功能，能够调节多种疾病的进展，与肿瘤细胞的增殖和转移密切相关[14]。目前有大量功能未知的lncRNAs尚待研究。虽然全基因组研究lncRNAs是揭示更多可能参与癌变或可能代表潜在治疗靶点的lncRNAs的好方法，但对各种研究结果进行直接比较仍然具有挑战性[11]。

Guo等[15]研究报道，C5orf66-AS1在食管鳞状细胞癌细胞中表达显著上调，增殖相关基因Ki-67和PCNA及EMT相关基因N-cadherin和Vimentin蛋白表达下调，参与侵袭转移途径的E-cadherin表达上调，提示C5orf66-AS1能抑制食管癌细胞的增殖和转移。Lu等[11]报道显示，在口腔鳞癌细胞中，C5orf66-AS1显著下调，C5orf66-AS1的过表达能够通过调控CYC1表达进而抑制口腔鳞癌细胞生长、转移和侵袭过程来抑制口腔鳞癌发展。Rui等[10]研究发现，C5orf66-AS1可通过与RING1和miR-637竞争，进而促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭和转移，抑制宫颈癌细胞的凋亡，从而作为原癌基因促进宫颈癌的发生发展。本研究通过检测C5orf66-AS1在不同直肠癌细胞系中的表达水平，发现C5orf66-AS1在直肠癌细胞系中水平显著上调，且在SW837细胞中最高。说明C5orf66-AS1在直肠癌细胞中属于癌基因。此外，已有研究报道发现，C5orf66-AS1在直肠癌组织中的表达低于癌旁正常组织[16]。本研究结果与其相反，推测可能是本研究所使用的分离直肠癌细胞株的组织来源与已有研究中所选取的患者组织部位、患病程度等存在差异性，表明C5orf66-AS1可能在不同的组织部位，不同患病程度中发挥不同的作用。

为了更进一步的研究C5orf66-AS1在直肠癌细胞中的作用，本研究通过使用siRNA干扰技术沉默C5orf66-AS1，通过检测干扰效率，选择干扰效率最高的si-C5orf66-AS1-3组作为后续沉默C5orf66-AS1表达组。通过进一步检测SW837细胞的增殖活性、凋亡率以及侵袭能力发现，沉默C5orf66-AS1可显著降低细胞的增殖活性和侵袭能力，提高细胞的凋亡率。以上结果说明抑制C5orf66-AS1表达可显著抑制SW837细胞的增殖、侵袭，促进其凋亡，可有效阻碍癌细胞的发生发展过程。

已有报道，Wnt/β-catenin信号通路是Wnt通路中的经典途径，可参与调控细胞的生物学过程(增殖、凋亡、侵袭和迁移等)，可在多种肿瘤细胞中被激活，进而促进肿瘤的发生发展过程[17-18]。已知Wnt/β-catenin信号传导通过调控多功能β-catenin蛋白的表达来调节广泛的细胞生物学过程，β-catenin是Wnt/β-catenin通路中的关键生长刺激因子，可影响细胞增殖、侵袭、分化和其他信号通路的激活[19]。有研究报道，PCNA是检测细胞增殖活性的指标之一，其表达水平与细胞的增殖状态密切相关，是DNA合成过程中不可或缺的因子[20]。Caspase-3活化可引起多种功能蛋白裂解，导致细胞凋亡，是凋亡的直接执行者[21]。Vimentin是间质细胞标志蛋白，可使肿瘤细胞获得游走能力，促进肿瘤细胞向周边组织侵袭及转移[22]。本研究通过检测SW837细胞中β-catenin、PCNA、Caspase-3和Vimentin的表达发现，抑制C5orf66-AS1表达可使细胞中β-catenin、PCNA和Vimentin蛋白水平显著下调，Caspase-3蛋白水平显著上调。说明抑制C5orf66-AS1可能通过抑制Wnt/β-catenin通路的激活，从而抑制直肠癌细胞PCNA的表达以及EMT发生，进而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，通过促进Caspase-3活化促进肿瘤细胞的凋亡过程。

综上所述，C5orf66-AS1在直肠癌细胞中高表达，抑制其表达可能通过抑制Wnt/β-catenin通路的激活，抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，促进细胞凋亡。C5orf66-AS1可能是直肠癌治疗的新靶点。本研究并未从反方向验证过表达C5orf66-AS1在直肠癌发生发展过程中的作用，以及是否还有其他通路参与调控，还需更深入的研究。