抑制YAP对宫颈癌细胞增殖、凋亡、迁移及p53、Fra-1表达的影响

李书萍，李 波，张 阳

(长沙市第四医院 妇产科，湖南 长沙 410006)

宫颈癌为女性生殖系统高发疾病，死亡率占女性肿瘤第二位。流行病调查显示，截止到2018年全球宫颈癌发病率为0.13%，死亡率较高，约80%发病人群来自经济落后国家[1]。宫颈癌发生发展是多种因素共同导致，主要与感染高危型人头瘤病毒(HPV)加快肿瘤细胞增殖加快病情发展有关[2]。p53是肿瘤抑制因子，恶性肿瘤产生与p53基因突变相关，p53修复功能被削弱时会转化为致癌基因加快肿瘤细胞活性恶化病情。外源性增加野生型p53可促进对宫颈癌细胞凋亡，合并放疗等治疗方式可降低肿瘤的生物活性[3]。Fra-1是位于机体染色体11q 3.1上的转录因子，Fra-1定位于细胞核具有调节细胞活性的作用。在胰腺癌及肺癌中发现Fra-1过表达状态，在宫颈癌组织表达低于癌旁组织[4]。

YAP即Yes相关性蛋白，具有调节器官发育及加快肿瘤形成等作用。YAP蛋白在多种恶性肿瘤表达上调，是评价肿瘤独立预后的指标之一。近些年，科学家们发现HIppo-YAP对肿瘤的发生发展具有重要作用。正常情况下YAP蛋白受严格控制的，YAP激活后即可造成非控制性增殖和凋亡抑制，进而导致恶性肿瘤产生。YAP是一个候选致癌因子，在宫颈癌患者存在HPV感染，肿瘤细胞快速增殖时YAP和磷酸化的YAP蛋白显著升高，当将YAP基因被敲除后，肿瘤细胞增殖被抑制，说明YAP可能是宫颈癌细胞HPV感染的重要介质[5]，但是具体研究机制还不得而知。本文通过外源性干预YAP蛋白观察其对细胞生物活性及p53、Fra-1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞来源、主要试剂与仪器 宫颈癌Hela/SiHa细胞株均购自上海信裕，本文研究符合我院伦理规定。主要试剂与仪器YAP-shRNA 及空载体质粒(中国上海吉玛公司)；p53抗体(中国深圳豪地华拓生物科技)；FRA1抗体(中国上海士峰生物)；DMEM培养、FBS、0.25%胰酶消化液(中国中盛溯源生物)；CCK8试剂、二甲基亚砜(DMSO)(上海蔚霆生物)；流式细胞仪(中国常州必达科生物科技)；Transwell 小室(中国北京优尼康生物)；蛋白垂直电泳系统(中国北京君意东方)；倒置生物显微镜(中国苏州景通仪器)；RT-PCR试剂(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将低温冷藏的Hela细胞株、SiHa细胞株，快速移入37℃水中溶解，离心后，离弃上清液，加入培养基，5% CO2常温保存，贴壁生长，次日更换培养基，细胞生长85%时，0.25%胰蛋白酶消化24 h，1∶3传代，取对数细胞1.0× 106/mL进行后续实验。

1.2.2 细胞转染及分组 取对数生长Hela细胞株、SiHa细胞株，接种6孔板中，细胞培养至80%～90%，把体积为4 μL脂质体和体积为200 μL缓冲液依次加入到无菌的EP管中，采用Lipofectamine2000将YAP-shRNA，YAP-shRNA-NC转染至Hela细胞，将细胞悬液加入6孔板,转染5 h后，继续培养，Hela细胞株、SiHa细胞株均分为3组，宫颈癌组(无转染的宫颈癌细胞)，NC组(宫颈癌组+YAP-shRNA-NC)及YAP-shRNA组(宫颈癌组+YAP-shRNA)。

1.2.3 RT-PCR检测3组细胞YAP、p53及FRA1基因水平 检测Hela细胞株、SiHa细胞株YAP表达，检测Hela细胞株p53及FRA1基因，严格按照PCR仪器说明书进行操作。各组宫颈癌细胞放入离心管中，1 000 r/min分离20 min，采用Trizol法提取总RNA，无核酸酶溶解。将提取的RNA进行转录为cDNA，获得反体系，条件为：42 ℃作用60 min，72 ℃作用5 min，4 ℃终点。每个细胞设置6个复孔，以β-actin为内参，反应条件为95 ℃预作用3 min，95 ℃作用5 s，58 ℃退火，40个循环。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.4 CCK8检测Hela细胞活力 取生长良好的对数生长细胞1.0× 106/mL的Hela细胞，进行Hela细胞活力实验，加入0.25%胰蛋白酶消化后，将Hela细胞制成悬浮液，放入离心管中，按照1 000 r/min分离5 min后，计算细胞数。按照每孔800个细胞，接种6孔板，饱和湿度常规培养，培养1、2、3 d后，加入20 μL，10%的CCK-8溶液，450 nm下计算每孔吸光值，绘制细胞生长曲线。

1.2.5 流式细胞仪检测Hela凋亡率 取生长良好的对数生长细胞1.0× 106/mL的Hela细胞接种到6孔板中，常规饱和湿度下进行培养，加入0.25%消化酶，离心机2 000 r/min运转10 min，加入1 mL PI染色进行染色，40～60 min后，采用流式细胞仪检测Hela凋亡程度。

1.2.6 Transwell小室法检测Hela细胞迁移能力 在培养室中防放置Transwell小室，上层加入Hela细胞悬液，下层加入少量胎牛血清培养基，将100 μg/mL TMP溶液加入至下室，37.5 ℃，培养24 h后，取出小室，棉签拭去残留Hela细胞，纯净水冲洗3次，甲醛固定15 min，显微镜×400倍下计算Hela细胞迁移数量，随机选择4个视野，取实验3次的平均值。

1.2.7 免疫印迹检测p53、Fra-1蛋白水平 细胞浓度及接种数量同上，加入0.25%消化液，放入离心管中分离上清液，提取蛋白，然后煮沸、变性，进行电泳，PVDF膜TBS浸泡10 min，反复PBS冲洗，5 min/次，分别加入p53、Fra-1，GAPDH抗体(1∶500)、二抗(1∶2 000)，杂交60 min后，纯净水反复冲洗3次，将膜浸入ECL液体中，检测获取图象。

2 结果

2.1 RT-PC检测Hela、SiHa细胞株中YAP基因水平 NC组与宫颈癌组Hela细胞株中YAP基因水平比较无统计学意义(P>0.05)，YAP-shRNA组中Hela细胞株中YAP基因水平均低于NC组与宫颈癌组，组间比较差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 Hela、SiHa细胞株中YAP基因水平比较(n=6)

2.2 Hela细胞增殖能力比较 宫颈癌组和NC组Hela细胞吸光度(A)值在24、48、72 h比较均无统计学差异(P>0.05)，YAP-shRNA组Hela细胞吸光度(A)值均低于宫颈癌组和NC组，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，并呈现时间依赖性(见表3)。

表3 各组Hela细胞增殖能力比较(n=6)

2.3 各组Hela细胞凋亡率比较 宫颈癌组、NC组和YAP-shRNA组Hela细胞凋亡率分别为(6.21±0.50、7.14±1.18、65.45±1.30)%，组间比较差异具有统计学意义(F=6221.000，P<0.001)。宫颈癌组和NC组Hela细胞凋亡率组间比较无统计学意义(P>0.05)，YAP-shRNA组Hela细胞凋亡率高于宫颈癌组(P<0.001)和NC组(P<0.001)(见图1)。

*：与宫颈癌组比较，P<0.05；&：与NC组比较，P<0.05。图1 各组Hela细胞凋亡率比较

2.4 Hela细胞迁移数目比较 宫颈癌组、NC组和YAP-shRNA组Hela细胞迁移数目分别为(85.1±12.03、83.9±13.5、41.39±7.50)个，组间比较差异具有统计学意义(F=6.645，P<0.001)。宫颈癌组和NC组Hela细胞迁移数目组间比较无统计学意义(P>0.05)，YAP-shRNA组Hela细胞迁移数目低于宫颈癌组(P<0.001)和NC组(P<0.001)(见图2)。

*：与宫颈癌组比较,P<0.05；&：与NC组比较,P<0.05。图2 各组Hela细胞迁移数目比较

2.5 Hela细胞p53、Fra-1蛋白水平比较 宫颈癌组、NC组和YAP-shRNA组Hela细胞p53蛋白表达水平分别为(1.03±0.17、0.98±0.16、2.23±0.26)，Fra-1蛋白表达水平分别(0.74±0.08、0.72±0.06、1.12±0.15)，组间比较差异具有统计学意义(Fp53蛋白=99.610，P<0.001；FFra-1蛋白=338.300，P<0.001)。宫颈癌组和NC组Hela细胞p53、Fra-1蛋白水平组间比较无统计学意义(P>0.05)，YAP-shRNA组Hela细胞p53蛋白水平高于宫颈癌组(P<0.001)和NC组(P<0.001)，YAP-shRNA组Hela细胞Fra-1蛋白水平高于宫颈癌组(P<0.001)和NC组(P<0.001)(见图3)。

*：与宫颈癌组比较，P<0.05；&：与NC组比较,P<0.05。图3 各组Hela细胞p53、Fra-1蛋白水平比较

2.6 Hela细胞p53、Fra-1 mRNA水平比较 宫颈癌组、NC组和YAP-shRNA组Hela细胞p53mRNA表达水平分别为(1.00±0.00、0.97±0.05、1.68±0.21)，Fra-1mRNA表达水平分别(1.00±0.00、0.95±0.08、1.37±0.18)，组间比较差异具有统计学意义(Fp53 mRNA=337.600，P<0.001；FFra-1 mRNA=292.800，P<0.001)。宫颈癌组和NC组Hela细胞p53mRNA、Fra-1mRNA水平组间比较无统计学意义(P>0.05)，YAP-shRNA组Hela细胞p53mRNA水平高于宫颈癌组(P<0.001)和NC组(P<0.001)，YAP-shRNA组Hela细胞Fra-1mRNA水平高于宫颈癌组(P<0.001)和NC组(P<0.001)(见图4)。

*：与宫颈癌组比较,P<0.05；&：与NC组比较,P<0.05。图4 各组Hela细胞p53、Fra-1 mRNA水平比较

3 讨论

YAP蛋白首次在哺乳动物细胞内发现，当与TEAD信号通路相结合后能抑制细胞凋亡。Hippo-YAP作为重要的信号传到信号通路，在肿瘤疾病中发挥重要生物学作用[6-8]。已经证实YAP蛋白在胃癌、卵巢癌及肺癌中表达上调，YAP-shRNA或体外干预能够通过抑制YAP蛋白而抑制肿瘤复制，改善病情[9]。Hela细胞生物学来源与美国女性的宫颈癌细胞系相比，具有增殖、迁移快的特点，常应用与宫颈癌实验研究。细胞增殖过程中细胞分裂是主要增殖方式，细胞凋亡属于主动过程，激活基因通过维持内环境稳定，从而调控细胞活性。在肿瘤状态下，YAP蛋白失效增加本身活性参与肿瘤的产生及发展[10-11]。裴峰等[12-13]表示通过体外建立宫颈癌细胞株实验，发现当敲除YAP蛋白时宫颈癌增殖及迁移能力降低。本文证实YAP-shRNA组Hela细胞出现大量凋亡，增殖及迁移数目均降低，说明YAP-shRNA能够抑制宫颈癌发展。沉默YAP蛋白后期诱导生长因子及凋亡抑制信号能力减弱，肿瘤抑制因子呈现高表达，从而减少宫颈癌细胞恶性增殖及迁移，细胞活性显著降低。YAP是Hippo通路的转录因子，其磷酸化后与相关因子结合可促进下游因子表达，提高肿瘤细胞的生物行为，因此抑制YAP蛋白的表达可有减缓肿瘤的发展。

p53是位于染色体17号短臂上的蛋白因子，进化相对保守，p53作用多样，能够修复损伤细胞，加快细胞灭活，抑制多种亲癌信号的表达[14]。p53可通过诱导相应编码的蛋白活性调节肿瘤细胞生物活性。p53主要分布于细胞浆内，在正常机体内p53具有监测基因组完整性作用，具有修复细胞基因损伤等特点，当p53基因发生突变时，会导致细胞癌变。相关文献证实，Hela细胞株中p53蛋白激活后诱导肿瘤细胞凋亡，p53表达激活后Hela细胞增殖分裂，减少Hela细胞从G期向S期扩增，改善宫颈癌病情[15]。本文证实YAP-shRNA组p53表达升高，产生原因在于抑制YAP后P53抑制肿瘤细胞分化能力增强，P53表达升高诱导Hela细胞凋亡。在肺癌细胞中，YAP蛋白活性表达下调时可激活p53基因表达，p53参与了YAP蛋白抑制肺癌细胞凋亡的过程[16]。在肝癌细胞中YAP蛋白能够发挥蛋白执行功能，能够上调p53水平发挥肿瘤抑制作用，进而加快肝癌细胞凋亡[17]。在食管癌Eca-109细胞中干扰YAP能够显著升高p53水平、降低食管癌细胞增殖分裂[18]。

宫颈癌中Fra-1及p53表达下调，而MDM2活性增加，体外实验表示，当敲除MDM2后，HPV病毒p53活性升高[19]。Henken等[20]研究发现过表达Fra-1能够降低MDM2水平。FRA1具有促进肿瘤增殖、分化、侵袭和凋亡等生物学功能，Fra-1在许多肿瘤中异常表达并发挥相关作用，Fra-1在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、鼻咽癌、甲状腺癌和其他癌症中过度表达肿瘤，但是宫颈癌中Fra-1的表达降低[21]。在口腔鳞状细胞癌中沉默YAP蛋白能够通过下调Fra-1水平而抑肿瘤细胞分裂增殖[22]。这与本文研究结果不同，其原因在于，Fra-1在不同肿瘤疾病作用机制存在差异性。但已有文献证实[23-24]，过表达Fra-1能够通过上调p53活性而减少Hela细胞的能量代谢及体外分裂，但是具体研究机制还需要进行后续实验。本文Hela细胞YAP-shRNA后，Fra-1表达升高，减少Hela生物学效应，减少肿瘤发生对于临床治疗有一定的参考价值。

本文未建立YAP蛋白过表达组，讨论中YAP与Fra-1之间的研究机制还需要进一步完善，对实验结果可能产生偏差，后期本课题组会加强和其他相关研究单位合作，增加样本量，细化实验内容，为宫颈癌临床研究提供实践依据。综上所述，YAP在宫颈癌细胞中存在高表达，沉默后能够降低宫颈癌Hela细胞株增殖及迁移能力，加快细胞凋亡率，这可能与激活P53及Fra-1基因相关。