转移性激素敏感性前列腺癌患者的CDK12突变频率及临床意义

张顺， 庄君龙， 邱雪峰， 金晶， 郭宏骞

前列腺癌是世界范围内男性发病率第二，病死率第五的癌种[1]。2015年我国肿瘤登记地区前列腺癌新发患者数超过6万人，位列男性恶性肿瘤发病人数的第6位[2]。一项北上广等地的调查研究显示，我国54%前列腺癌初诊患者有骨转移或内脏转移[3]，发现即晚期因此错过根治手术时间[4-5]。最初的转移性患者在初始治疗阶段都属于转移性激素敏感性前列腺癌(metastatic hormone sensitive prostate cancer, mHSPC)，但在内分泌治疗一段时间发生进展后将转变为转移性去势抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC)。患者一旦进入mCRPC阶段，预后一般较差。因此，及时筛选出mHSPC阶段不良预后患者，并采取更积极的治疗，将有助于延长患者生存期。

随着肿瘤分子生物学的发展，现已揭示了部分前列腺癌预后相关基因，如CDK12[6]、PTEN[7]、TP53[8]等。CDK12属于细胞周期依赖性蛋白，可通过调节DNA损伤反应相关基因来控制基因组稳定性[6]。有研究发现中国人CDK12突变的比例为15.4%[9]，显著高于先前报道的高加索人的突变频率5%～7%[10-12]。另外，相较于mHSPC，CDK12突变频率在mCRPC患者当中比例更高[6]。目前针对CDK12突变的研究大多属于mCRPC阶段。因此，探索中国人群中mHSPC患者的CDK12突变频率，有助于明确其对mHSPC阶段的预后作用。

本研究收集了91例mHSPC阶段的患者，通过第二代测序NGS检测技术，同时分析患者的胚系和体系突变情况，筛选出有CDK12胚系或体系有害突变的患者，并对患者进行长期随访，通过患者进展至mCRPC阶段的时间分析CDK12突变的预后作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科2019年1月至2020年11月间临床资料齐全且病理组织石蜡标本能满足基因检测要求的91例病例，均为行前列腺癌穿刺活检初诊为mHSPC。患者确诊时年龄42～86岁，平均(68.35±6.80)岁。按照国际泌尿病理协会(ISUP)分级分组1组1例，2组3例，3组8例，4组41例，5组38例。临床病理分期按照美国癌症分期联合委员会(AJCC)制定的TNM分期标准确定，远处转移M分期中M1a期22例， M1b期60例，M1c期9例。临床治疗方案以雄激素剥夺治疗(androgen-deprivation therapy，ADT)为基础的联合治疗方案为主，主要包括ADT联合比卡鲁胺、ADT联合醋酸阿比特龙及ADT联合多西他赛。依据前列腺癌临床试验工作组3(the Prostate Cancer Clinical Trials Working Group 3,PCWG3)的标准，收集患者从mHSPC进展至mCRPC阶段时间。

1.2 组织、血液样本采集 组织样本采集：收集mHSPC患者肿瘤穿刺组织1～2条或白片10～15片。血液标本采集：使用 Streck采血管采集治疗前≥10 ml外周血，采血后立即轻柔颠倒 10 次使血液与管内成分混匀。

1.3 NGS测序法 采用Nanodrop 检测 DNA 的纯度(OD260/280比值)；DNA的降解程度用琼脂糖凝胶电泳进行分析，并用该电泳同时判断是否有蛋白质以及RNA的污染；通过Qubit荧光计对DNA浓度进行高灵敏度、高特异性以及高精确度的定量分析；利用破碎仪将基因组DNA进行随机打断，打断后的片段长度在180～280 bp之间， 随后对打断的片段进行末端修复以及加A尾，处理完毕后通过在片段的两端连上接头，进而制备DNA文库。构建好文库后，基因片段便带有特异性标签。将生物素标记的探针与index文库进行液相杂交，再加入带链霉素的磁珠抓取杂交复合状态的DNA，在洗脱缓冲液中洗脱目标文库，并得到基因组中的外显子片段，通过PCR进行线性扩增，扩增后再对文库进行质检，以确保结果的准确性，检测合格后上机测序。通过对测序数据量、比对率、错误率等进行统计，进而评估测序数据的质量，判断建库测序是否达到了标准，如果符合标准则进行后续的分析，不符合标准者重新建库或加测。将高质量的序列与人参考基因组进行比对，检测样本中的变异信息，包括点突变、插入/删除、拷贝数变异，并对检出的变异进行分析解读。通过血液中白细胞的对照，同时分析胚系和体系突变情况。

1.4 统计学方法 使用IBM SPSS Statistics 22.0统计软件进行相应的统计分析。其中正态分布的计量资料以平均数±标准差表示，采用独立样本t检验分析组间差异。非正态分布的计量资料以四分位数表示，采用秩和检验分析组间差异。计数资料以例(%)表示，采用χ2检验分析组间差异。P<0.05为差异具有统计学意义。

因有研究显示CDK12突变型患者进展至mCRPC的中位时间在9～10个月，而CDK12野生型患者进展至mCRPC的中位时间在13～18个月[6，13-14]。因此本研究将mHSPC患者初始治疗后12个月内是否进展作为预后观察指标。CDK12是否突变与mHSPC患者是否在12月内进展为mCRPC的关系采用连续性校正χ2检验分析。对mHSPC患者在12个月内进展至mCRPC的相关危险因素进行单因素及多因素Logistic回归分析。

2 结果

2.1 NGS测序结果及CDK12突变型或野生型两组患者基线资料 91例mHSPC患者中存在有害突变或临床意义未明突变频率排名前五的分别是FOXA1(31例，34.06%)，SPOP(19例，20.89%)，CDK12(19例，20.89%)，BRCA2(18例，19.78%)，TP53(16例，17.58%)(图1)。19例CDK12突变患者中有11例检测出胚系或体系的有害突变，突变频率为12.09%。

注：图中左侧条状列出了检测到的所有突变基因及对应的突变频率，该频率包括有害突变或临床意义未明突变；图中右侧彩色方格代表突变形式，每例患者每个基因的突变形式都纵向体现在图中的方格中；图中上方对应的是每例患者的突变密度图1 91例 mHSPC患者的突变图谱

两组患者确诊时候的年龄、前列腺特异性抗原(PSA)、ISUP分组、远处转移M分期情况、随访时间及mHSPC期间治疗情况比较差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 91例mHSPC患者的临床信息

2.2 CDK12突变状态与mHSPC患者进展至mCRPC阶段时间的关系 对91例mHSPC患者进行随访，发现CDK12突变型患者在12个月内进展至mCRPC的有7例，进展率为63.64%(7/11)；CDK12野生型患者在12个月内进展至mCRPC的有18例，进展率为22.50%(18/80)。CDK12突变状态与mHSPC患者进展至mCRPC阶段的时间差异具有统计学意义(χ2=6.278，P=0.012)。

2.3 其他临床特点与进展至mCRPC阶段时间相关因素单因素和多因素分析 将表1中相关因素作为协变量，以mHSPC在12个月内是否发生进展作为因变量进行Logistic回归分析：CDK12突变型(OR=6.03，95%CI：1.59～22.93，P=0.015)及ISUP分组(OR=2.81，95%CI：1.23～6.92，P=0.013)是mHSPC患者在12个月内发生进展的独立影响因素，具体参数见表2。

表2 mHSPC进展至mCRPC阶段时间相关因素的Logistic回归分析

3 讨论

周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)是调节几个关键细胞过程的重要激酶，可调控细胞周期进展和调控基因转录[6]。其中细胞周期依赖性蛋白12(cyclin-dependent kinase 12，CDK12)是转录相关基因，由不同的功能结构域组成：一个位于中心位置的结构域，N-末端附近的几个精氨酸/丝氨酸序列，以及一个富含脯氨酸的序列[15]。CDK12可以调节DNA损伤修复基因在内的基因转录，当CDK12蛋白功能失活时，DNA损伤修复基因表达缺陷，易引起基因融合增加和基因表达显著差异，导致肿瘤的发生与发展，其变异频率在CDK家族中是最高的[6]。实体瘤中，前列腺癌发生CDK12基因变异的频率最高[6]，3%～7%的mCRPC患者存在CDK12基因突变[16]。本研究结果显示，在中国人群mHSPC患者中，CDK12有害突变的频率为12.09%。而高加索人在mCRPC阶段CDK12的突变频率仅为5～7%[10-12]。中国人群CDK12突变频率是高加索人的1.7～2.4倍。另外，CDK12突变频率在mCRPC患者中的比例要比mHSPC阶段更高[6]。中国人群在CDK12突变频率偏低的mHSPC阶段的数据，都已远远超过了高加索人在mCRPC阶段的数据。由此可见，中国人群和高加索人在基因组学上存在较大差异，CDK12基因在中国人群中的突变频率远高于外国人群。

目前CDK12在细胞中的具体作用机制还不完全清楚，但它在DDR通路中有着不可替代的作用[17]。据报道，CDK12 在维持同源重组修复转录活性、保持基因组稳定性以及促进DNA损伤修复过程中起着重要的调节作用。DNA 损伤累积和DDR破坏是恶性肿瘤的典型特征之一[18]，因此CDK12突变与肿瘤发生和进展紧密相关。目前已有不少研究显示，CDK12突变与前列腺癌的不良预后相关。Nguyen等[6]将CDK12突变组患者与CDK12野生型患者相比，发现CDK12突变组患者从诊断转移性前列腺癌开始的总生存期较短，并且进展至CRPC的时间较短。Warner等[13]将12例CDK12缺陷的患者与187例未检测到胚系/体系CDK12缺陷的转移性前列腺癌患者相比，发现CDK12缺陷的患者从ADT开始到CRPC进展的时间显著缩短，且在mCRPC一线新型内分泌治疗后的PSA进展时间较短。且CDK12突变的患者进展至mCRPC的中位时间在9～10个月，而CDK12野生型患者进展至mCRPC的中位时间在13～18个月[6，13-14]。因此，本研究将mHSPC患者初始治疗后在12个月内是否进展作为预后观察指标。基于中国人群，对mHSPC阶段CDK12基因突变患者进行了临床特征分析。通过χ2检验以及Logistic回归多因素分析的研究结果显示，CDK12突变与mHSPC患者进展至mCRPC阶段的时间差异具有统计学意义(P<0.05)，具有CDK12突变的mHSPC患者的预后情况普遍较差，与先前的报道结果一致。在Logistic回归的多因素分析中，除了CDK12突变以外，ISUP分组也是mHSPC患者在12个月内发生进展的独立影响因素。

CDK12突变的mHSPC表现出更强的侵袭性行为，患者预后较差，且前列腺癌中CDK12的突变又在中国人群中有较高的比例，因此，CDK12值得引起泌尿外科的高度重视。对CDK12突变的前列腺癌患者，使用新型内分泌治疗的疗效往往不佳[9，13]。本研究结果也提示CDK12突变型mHSPC患者一线标准治疗方案包括ADT联合比卡鲁胺或醋酸阿比特龙或多西他赛均疗效欠佳。但CDK12会影响DNA损伤修复，表现为“类同源重组修复缺陷”作用，从而增加新抗原负荷和T细胞浸润，引起免疫应答[19]。CDK12 基因影响DNA 的修复包括同源重组修复和炎症相关表型。因此，有研究报道有CDK12突变的前列腺癌患者对铂类化疗和免疫治疗有较好的响应[9，20]。那么后续对有CDK12突变的mHSPC患者，是否可以使用铂类或免疫等更加积极的治疗方式，进而延长患者生存期，值得进一步研究和探讨。

本研究仍存在一些不足，因目前基因检测费用较高，收集样本量有限且非连续人群，存在一定的选择偏倚。另外因随访时间偏短，无法得到所有患者进展至mCRPC的具体时间，所以采用治疗12个月内是否进展作为疗效观察指标也存在一定的偏差。这需要在后续收集更多的样本和更长的随访时间，为指导中国人群中mHSPC患者的CDK12突变频率及临床意义提供更详实、可靠的依据。