NF-КBp65 在鼻咽癌组织的表达及临床病理意义*

周梅 姬文莉 周小军 禤瑞霞 陈钰伟 王书芹

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是鼻咽部的恶性肿瘤，具有独特的地理分布特点，2018 年国际癌症研究机构报告的70%以上的新增病例发生在东亚和东南亚[1]。鼻咽癌在我国多发于南方，尤其是两广地区，发病率有逐年上升趋势。鼻咽癌恶性程度较高，具有很强的侵袭性，易发生局部浸润及颈部淋巴结转移，很多鼻咽癌患者直到晚期才被诊断，因此存活率较低，如何有效预测鼻咽癌的侵袭转移潜能，寻找潜在的分子治疗靶点，对于选择合适的治疗方案及判断预后具有重要意义。

NF-КBp65（nuclear transcription factor-p65,NF-КB-p65）是重要的核转录调节因子，参与调控机体多条关键信号转导通路，与多种肿瘤细胞的增殖和凋亡相关[2]。据报道NF-КB 在多种恶性肿瘤中被激活，如淋巴瘤、胃肠道肿瘤、妇科肿瘤、胸部肿瘤、头颈部肿瘤和泌尿生殖系肿瘤。但NF-КB 与广东地区鼻咽癌的关系尚未明确，本研究运用免疫组化和RT-PCR 的方法检测NF-КB p65 蛋白和mRNA 在广东地区鼻咽癌组织中的表达情况，分析其与鼻咽癌各临床病理指标间的关系，探讨NF-КB p65 在鼻咽癌发生发展中的作用，为预后判断和靶向治疗方面提供一定的实验依据。

资料与方法

1 一般资料

收集2018 年1 月～2019 年12 月广东中山市中医院病理科存档鼻咽蜡块90 例，其中鼻咽癌60 例（男性41 例，女性19 例），本组男性发病稍高，鼻咽炎组织30 例，鼻咽癌患者的年龄分布为16～80 岁，平均（49.1±14.0）岁。根据分化程度，鼻咽癌可分为3种组织学类型:非角化性癌（分化型和未分化型）、角化性和基底样型鳞状细胞癌。鼻咽癌的组织学分型及分期标准参照2006 年世界卫生组织的标准[3]。

2 主要试剂及方法

2.1 免疫组织化学

NF-КBp65 一抗购自Santa Cruz 公司，二抗购自福州迈新公司。所有样本均按照说明书的程序处理。切4μm 厚粘胶白片，用二甲苯和酒精脱蜡，柠檬酸盐缓冲液高压修复抗原4min，加过氧化氢10min，阻断内源性过氧化物酶活性，切片用10%的山羊血清阻断，NF-КBp65（1:200）一抗孵育2h，二抗孵育30min，DAB 显色，脱水，封片。

2.2 结果判定

所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4μm 厚连续切片，敷贴于10%多聚赖氨酸预处理的载玻片上。NF-КBp65 蛋白阳性表达为胞质内出现棕黄色颗粒。阳性染色强度评分：无染色颗粒为0 分，微弱染色颗粒为1 分，清晰染色颗粒且细胞质呈棕黄色为2 分，细胞质呈深棕色为3 分；阳性细胞数评分：无阳性细胞为0 分，阳性细胞数≤20%为1 分，阳性细胞数21%～50%为2 分，阳性细胞数>50%为3 分；上述两项评分相乘，0～2 分为阴性，≥3 分为阳性表达。

2.3 提取总RNA 与合成cDNA

取样本6 片，厚6μm，用QIAquick PCR Purification Kit 试剂盒（美国，QIAGEN）提取总RNA，测其纯度(紫外分光法)，按逆转录试剂盒（Promega 生物公司）说明书进行反转录，将500ng 总RNA 加入20μL 反应体系中，经37℃15min、85℃5s、4℃延伸，获得cDNA 后行PCR 检测或冰箱（-20℃）保存备用。

2.4 RT-PCR 检测

检测NF-КBp65 mRNA 的相对表达量，RTPCR 具体操作步骤按试剂盒说明书进行。反应体系：SYBR 10μL，上下游引物各0.4μL，cDNA2μL，加入去离子水至20μL；在实时荧光定量PCR 仪上进行热循环反应，PCR 反应条件：95℃30min 预变性；95℃5s，60℃30s，PCR 循环40 次；溶解并绘制溶解曲线：95℃15s、60℃15s、45℃15s。每份样本设3 个复孔，重复3 次。依据内参的标准化计算目的基因相对表达量。引物由上海生工生物公司合成。NFКBp65-上游引物：5'-CGCGGATCCGCCACCATGGA CGAACTG-3'，NF-КBp65-下游引物：5'-CCGCTCG AGTTAGGAGCTGATCTG-3'；内参GAPDH-上游引物：5'-TCGACCAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3'，GAPDH-下游引物：5'-ACCAAATCCGTTGACTCCG ACCTT-3'。

3 统计学分析

采用SPSS 软件进行统计学分析（版本17.0），数据资料以±s 表示，两组间的比较用t 检验，各组间频数的比较用χ2检验，以P＜0.05 差异统计学意义。

结果

1 NF-КBp65 蛋白在鼻咽癌和鼻咽炎组织中的表达活性比较

采用免疫组织化学方法检测NF-КBp65 蛋白的表达，结果表明NF-КBp65 蛋白在鼻咽癌组织中高表达（图1A）。在鼻咽炎中低表达或阴性（图1B）。NF-КBp65 蛋白在鼻咽癌组织中的阳性表达率为88.3%，在鼻咽炎组织中的阳性表达率为60%，NFКBp65 蛋白在鼻咽癌组织中的阳性表达率明显高于鼻咽炎组织（P<0.05)，见表1。

表1 NF-КBp65 蛋白在鼻咽癌和鼻咽炎组织中的表达活性比较

图1 免疫组化染色

2 NF-КBp65 蛋白表达与鼻咽癌临床病理特征的关系

在鼻咽癌中，NF-КBp65 蛋白的阳性表达率与鼻咽癌肿瘤大小、淋巴结转移、TNM 分期均具有相关性（P<0.05），肿瘤体积越大、有淋巴结转移、TNM分期越高的鼻咽癌NF-КBp65 蛋白的阳性表达率越高；但NF-КBp65 蛋白的阳性表达率与性别、年龄、组织学分型无显著相关性（P>0.05），见表2。

表2 鼻咽癌组织NF-КBp65 蛋白表达与临床病理特征的关系

3 NF-КBp65 mRNA 在鼻咽癌与鼻咽炎组织中的表达活性比较

NF-КBp65 mRNA 表达水平运用相对定量法通过2-ΔΔct计算。观察溶解曲线及扩增循环图，了解扩增情况（图3）。NF-КBp65 mRNA 在鼻咽癌中的相对表达量（0.6237±1.2085）明显高于鼻咽炎组织（0.3414±0.2497），差异有统计学意义（P<0.05），见图4。

图3 荧光定量扩增曲线图

图4 NF-КBp65mRNA 在鼻咽癌和鼻咽炎中的相对表达量

4 NF-КBp65 mRNA 表达活性与鼻咽癌临床病理特征的相关性分析

RT-PCR 结果显示，NF-КBp65 mRNA 在鼻咽癌T1 组中的相对表达量明显高于T2+T3 组（P<0.05）；NF-КBp65 mRNA 在鼻咽癌有淋巴结转移组中的相对表达量明显高于无淋巴结转移组（P<0.05）；NF-КBp65 mRNA 在III-IV 期鼻咽癌组织中相对表达量明显高于I-II 期（P<0.05）；NF-КBp65 mRNA 表达与鼻咽癌肿瘤大小、淋巴结转移状况、临床分期相关，而与组织学分级无显著相关性（P>0.05），见表3。

表3 鼻咽癌组织NF-КBp65 mRNA 表达活性与临床病理特征的关系

讨论

鼻咽癌具有多个风险因素，包括爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）感染、遗传易感性和环境因素等，其中EB 病毒与鼻咽癌的发生关系最密切，血液循环中的病毒DNA 是检测鼻咽癌高度敏感和特异性的检测标记[4]。由于鼻咽癌的位置较深，与颅底紧密相连，且鼻咽癌具有较强的侵袭性，极易侵犯颅底、咽旁及颈动脉鞘等周围组织结构。鼻咽癌的主要治疗手段为放射治疗。早期鼻咽癌的治疗效果较为显著，但局部进展的鼻咽癌存活期仍不理想。Sun 等[5]研究报道Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者的5年生存率分别为72%、64%、62%和38%。由于早期鼻咽癌的临床症状多不典型，且病变较为隐匿，患者就诊时往往已到中晚期，远处转移及局部复发是鼻咽癌治疗失败的主要原因，然而目前为止鼻咽癌转移的分子病理机制尚未完全阐明。

NF-КB 家族参与许多信号传导途径，失调可导致包括癌症和炎症疾病在内的多种疾病[6]。它涉及调节大约150 个基因的激活，这些基因涉及从免疫反应到代谢多种功能[7]。NF-КB 信号系统是一个高度动态的蛋白质相互作用网络，由相互调节的几种成分组成，该系统包括五个转录单体，两个前体蛋白，三个包含抑制性IКB 蛋白的锚蛋白重复序列，三个刺激反应抑制激酶（IKK 复合物：IKK-α 和IKK-β，以及IKK-γ 或NF-КB 必需调节剂/NEMO）和锚蛋白重复序列[8]。NF-КB 家族共有五个成员，p65（RelA），RelB，c-Rel，p105/p50（NF-КB1）和p100/52（NF-КB2）[9]，NF-КB p65 亚基被认为是该家族中最有效的转录激活因子[10]，p65 在细胞质中与p50 形成稳定的异二聚体[11]，在未受刺激的细胞中，p65-p50 二聚体与КB 蛋白抑制剂(IКB)结合，经典激活途径通常由NEMO 依赖的IKK 激活触发，IКB 蛋白磷酸化，随后泛素化并被蛋白酶体降解，随后，p65/p50 异二聚体转位进入细胞核[10]，异二聚体通过保守的Rel 同源区域（RHR）与目标DNA 调控元件结合[12]，与DNA 结合后，p65 介导的转录激活受两个反式激活域（TAD）TAD1 和TAD2 的控制，通过TAD1 和TAD2 介导的蛋白质相互作用，在目标基因的启动子处募集转录调节子，最终导致RNA聚合酶II（RNA pol-II）的募集和基因的表达激活[13]。

研究发现NF-КB 在乳腺、肺、膀胱和卵巢癌中过表达，NF-КB 的过表达进一步促进了肿瘤的发展[14]。该信号系统可能促成鼻咽癌的发生，其与EBV 感染和大量淋巴样浸润密切相关。从本研究结果分析可以看出，在鼻咽癌中，NF-КB p65 蛋白和mRNA 的阳性表达率明显高于鼻咽炎组织（P<0.05）；且NFКBp65 蛋白的阳性表达率与肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期相关（P<0.05）；NF-КBp65 mRNA 在不同肿瘤大小、淋巴结转移和TNM 分期中的相对表达量差异具有统计学意义（P<0.05），在肿瘤较大、有淋巴结转移和TNM 分期较高的鼻咽癌中NFКBp65 mRNA 的相对表达量越高，NF-КBp65 蛋白和mRNA 表达与鼻咽癌临床病理诸因素的关系密切，提示NF-КBp65 表达越高的鼻咽癌增殖速度越快，侵袭性越强，易发生转移，临床分期越晚，预后越差，NF-КBp65 可能参与鼻咽癌的发生和发展，NF-КBp65 过表达可能是判断鼻咽癌患者预后的独立因素。NF-КB 信号的异常激活导致调控凋亡、增殖、转移和放射治疗抗性的各种基因的异常表达[15]，是癌症治疗的靶点[16]，临床试验已发现用于NF-КB通路靶向治疗的不同分子抑制剂，通过抑制其活性，达到抑制肿瘤细胞的耐药、提高抗肿瘤药物的敏感性、促进肿瘤细胞的凋亡等作用，从而提高抗肿瘤治疗的疗效[17]。

综上所述，NF-КBp65 与鼻咽癌的临床病理特征有关，其过度表达与预后不良有密切关系，提示NF-КBp65 可能参与鼻咽癌的发生发展过程，NFКBp65 高表达在鼻咽癌浸润转移中发挥重要的作用，本研究可能为研究鼻咽癌发生机制和治疗靶点提供理论依据。