细胞薄片组织工程及其临床转化的研究进展

俞杭，王经琳，2，任昊桢，2，施晓雷，2

(1.南京中医药大学 中西医结合鼓楼临床医学院，江苏 南京 210046；2.南京大学医学院附属鼓楼医院 普外科，江苏 南京 210008)

1 细胞薄片组织工程

组织工程的概念是由Vacanti等提出[1]。在医学方面，组织工程的目的是在生长因子存在的情况下将可生物降解的支架与细胞结合起来，期望细胞和组织作为药物直接治疗疾病。已有研究表明一些人类器官组织的构建已取得了成功，如在老鼠背上构建人耳以及心脏瓣膜[2]、角膜[3]、骨[4]和软骨[5]等组织。有研究人员提出的“细胞薄片组织工程”[6]是一种无支架的细胞薄片组织工程技术，该技术可以避免支架材料和胰酶带来的不良影响以及获取过程中对细胞的损害。相比于细胞悬液的直接输注，细胞薄片可以直接覆盖在靶器官或组织上，这极大地提高了细胞疗法的治疗效果。获得的细胞薄片也可通过组织工程技术进一步叠加组装形成3D结构，即高细胞密度、功能化的组织。细胞薄片组织工程已在人类多个器官进行临床应用，包括心脏[7]、角膜[8]、食道[9]、牙周[10-11]、软骨[12]以及肝脏[13]。

2 细胞薄片的制备和性质

2.1 细胞薄片的制备和收获

由于培养的细胞通常通过内源性黏附蛋白(细胞外基质和细胞膜受体)坚固地附着在细胞培养皿上，因此必须去除这些黏附蛋白才能从培养皿表面获取细胞。一般使用化学分离法和物理分离法两种方法来分离贴壁细胞。化学分离法即在培养皿中加入蛋白水解酶来消化细胞，使之脱落。但一般的非特异性酶消化后会沉积在细胞膜以及培养皿表面，这种不受控制的蛋白水解会损害多种重要的细胞功能，例如细胞增殖、黏附、存活和迁移。由于使用该方法最终得到的是单细胞悬液，所以其中组织形成和植入所需的内源性细胞之间的联合都已被破坏。这种方法的缺点是当在体内注射悬浮细胞时，由于黏附蛋白的破坏阻止了细胞与宿主组织的结合并降低了细胞的整体活性[14-15]，因此酶处理后的细胞会被排除在靶部位，极大地降低了疗效。另外还有使用乙二胺四乙酸(EDTA)作为螯合剂去除整合素和细胞结合蛋白中的钙离子来释放细胞[16]，这种方法不需要外源性的酶作用，但却存在EDTA细胞毒性[17]。而物理分离法即是采用一种“支架”技术，该技术能为细胞生长提供一个特定的环境，并且细胞的原有结构不会被破坏，但该技术仍存在一些限制，如细胞向支架内迁移不足，细胞和营养物质对支架的渗透性较差。此外，支架的降解会引起炎症，对支架植入后在体内的稳定性有所影响[18-19]。

针对这些问题，有研究人员提出了一种制备、收获和移植细胞薄片的无支架组织工程，即所谓的“细胞薄片组织工程”[20]，它是将培养的细胞制备成细胞薄片的形式，通过把细胞薄片移植到受损组织或器官上来达到治疗效果。该技术利用了微小的温度变化来获取培养的细胞，而且无需蛋白水解酶的处理，不会发生细胞或蛋白质的破坏。这种细胞薄片技术需要使用独特的细胞培养皿，即用温度敏感型聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)的薄层敷在聚苯乙烯培养皿上[21-22]，覆盖后的培养皿称为温度敏感型细胞培养皿(TRCD)。PIPAAm的临界溶液温度为32 ℃，制备细胞薄片时只需将细胞在37 ℃条件下在TRCD上培养，当把环境温度降至32 ℃以下时(一般为20 ℃)，TRCD表面的PIPAAm聚合物会迅速从疏水变为亲水，水介质在低于32 ℃的温度下自发渗透到黏附细胞和TRCD之间的PIPAAm聚合物界面，在水合作用下PIPAAm快速水化并溶胀，将细胞表面与TRCD表面分开。采用这种方法无需任何酶处理即可在TRCD上获得贴壁的培养细胞，而且是连续完整的活细胞薄片。这种细胞薄片技术是一种温和、无干扰的采集细胞的独特方法，能够从TRCD中采集贴壁细胞，而不会损害细胞外基质、细胞表面蛋白、细胞受体以及对细胞生存和功能至关重要的细胞间蛋白。

2.2 细胞薄片组织工程细胞的活性与表征

细胞疗法的关键是细胞进入人体后所具有的活性，这关系到其发挥治疗作用的强弱。Nagamoto等[23]在24孔板中培养诱导多能干细胞(iPSCs)诱导的人肝细胞样细胞，2 d后收获的细胞薄片大约有8×105个细胞，且经过HE染色以及验证特征性标志物表达等实验证实，收获的细胞薄片在细胞活性以及特征标志物的表达上都与普通细胞培养皿上培养的细胞相似，即使在温度降低到27 ℃时收获的细胞薄片，也并不影响其活性与特征性标志物的表达。这表明细胞薄片在细胞回收率以及细胞活性和性能等方面都满足了细胞疗法的需要。Forghani等[24]对人体脂肪来源干细胞(hASCs)所形成的细胞薄片进行细胞形态、存活率、增殖和分化潜力的评估，结果显示hASCs细胞薄片在达到80%～90%汇合度之前仍在增殖。获取细胞薄片后将其重新接种在常规细胞培养皿上，hASCs依旧能黏附并增殖。研究人员通过检测hASCs细胞薄片的成骨能力来证明其分化潜力，结果发现在培养的第14天，hASCs细胞薄片中骨钙素的表达相较于普通培养皿培养的hASCs明显增加。同样，茜素红染色发现hASCs细胞薄片中钙的沉积也呈明显增高趋势。有研究人员构建了人角质细胞-成纤维细胞细胞薄片[25]，在细胞活性和增殖性能方面都予以了证明，并通过HE以及Vimintin染色证实了收获的细胞薄片中相关细胞标志物的存在，即细胞薄片具有单纯细胞所具有的表征。以上结果表明细胞薄片作为新兴的细胞移植疗法是可行的，结合其对于靶器官强大的定植效果，细胞薄片相较于悬浮细胞疗法更具优势。

3 细胞薄片的应用

细胞薄片组织工程的优势在人体细胞移植的临床研究中已得到证实，TRCD的使用使我们能够在保留重要的细胞间连接和相关的细胞外基质的情况下获得治疗性细胞[26]。保存下来的细胞外基质起到了类似“胶水”的作用，将细胞膜与宿主细胞紧密地结合在一起。因此，细胞移植可以在不使用人工支架或缝合等额外治疗的情况下完成。有了这些优点，人类对基于细胞薄片的组织再生的临床研究又近了一步。

3.1 基于细胞薄片的肝脏组织工程

由于供肝短缺严重制约了原位肝移植的发展，因此肝再生疗法已成为治疗肝病的一种新的有前景的治疗方法，由此发现了通过将新鲜收获的肝细胞注射到脾脏或门静脉内来研究使用肝细胞的细胞疗法[27]。在一项研究[28]中，从表达人α1抗胰蛋白酶(hA1AT)的转基因小鼠中分离出肝细胞，将肝组织片移植到带血管的小鼠皮下组织并且通过肝门静脉注射肝细胞悬液，比较两种方法的体内细胞存活率以及小鼠血清中hA1AT水平，以测量移植细胞的活性。结果发现，肝细胞薄片组中移植细胞分泌的蛋白质浓度显著高于细胞悬液注射组。这表明细胞薄片技术可以有效地将治疗细胞定位于具有针对肝脏再生的靶向组织，而且通过TRCD培育出来的肝细胞薄片包含有保持肝脏特异性功能的结构，如桥粒、缝隙连接和胆小管。此外，来自于人骨髓间充质干细胞或iPSCs的肝细胞样细胞也可被制造成细胞薄片[23,29]。由于活组织由多种细胞类型组成，细胞间的相互作用影响和维持生理功能和活动的发展，特别是在正常培养条件下，内皮细胞为肝细胞提供合适的环境，由此可以通过一种共培养技术将内皮细胞与肝细胞共同培养以在体外支持肝细胞的功能。通过这些技术，可移植的组织工程肝脏会成为治疗肝病的另一种选择。

3.2 基于细胞薄片的心脏组织工程

成肌细胞膜可以用于治疗严重的心脏病，因为移植的细胞膜结构提供了旁分泌效应，这种旁分泌效应可以持续且局部地传递到受损组织。另外，一些研究集中在构建组织工程心脏作为再生医学或组织模型中的可移植心脏，以发现治疗心脏疾病的药物[30]。在细胞薄片技术的帮助下，细胞膜之间能快速建立缝隙连接以及多个细胞膜的脉动同步[31]。有研究将细胞薄片结构移植到梗死的大鼠心脏上，心肌细胞通过桥接从移植物迁移到宿主心脏上，并且显示了形态和功能上的联系[30]。显然，与直接细胞注射相比，心肌细胞薄片移植显示出更好的细胞存活率和植入性。

将多个细胞薄片叠加可以产生3D心肌组织，但是在长期的体外培养中会发现严重的坏死。所以为了大规模的生产细胞薄片结构，需要让这些组织血管化以提供足够的氧气和营养[32]。通常情况下受者的血管侵入移植组织后，氧气和营养物质被输送到组织内，然而移植的组织往往在新生血管形成前就已坏死。因此有研究发现把移植组织与内皮细胞(ECs)共培养是一种促进血管形成的很有前途的方法，该方法是将ECs夹在两个细胞薄片之间来形成一个多层细胞薄片结构，ECs可以在这个结构中形成血管样分支网络，这就促进了移植后血管化以及移植后组织与宿主血管的连接[33]。

3.3 角膜细胞薄片组织工程

角膜疾病是全球第5大致盲原因，此类疾病中的大多数都可以通过角膜移植来治愈，但可移植的角膜数量限制了这个方法。最初用于眼表重建的组织工程学方法是使用羊膜[34]或纤维蛋白凝胶，但由于羊膜和纤维蛋白凝胶都是生物材料，不能排除感染的风险，并且术后羊膜的存在会降低透明度，影响患者恢复视力，因此已很少使用。为了提供可移植角膜的替代品，可以通过组织工程技术生产的活体角膜替代物在细胞表型和组织结构方面取得一些进展，旨在模仿体内的角膜替代物。已有研究描述了使用未转化的人角膜上皮细胞生产三维组织工程化角膜的方法[3]，在TRCD上降温收获细胞薄片后可以直接放置在宿主角膜基质上，不需要缝合就能快速黏附[35]，培养出的细胞薄片显示出适当的组织学以及细胞外基质(ECM)成分和整合素的表达。移植后，细胞薄片可以覆盖整个角膜而且表面清晰光滑。有研究进一步提出了用自体口腔黏膜上皮细胞作为重建角膜表面的细胞来源[36]，在TRCD上培养的口腔黏膜上皮更接近于天然角膜上皮而不是天然口腔黏膜上皮，在人类患者身上进行移植的结果也表明丧失的视力已经恢复，角膜透明性保持了1年以上[36]。由于细胞薄片的构成仅为细胞与ECM[33]，并不含有其它异体材料，所以细胞薄片并不属于生物材料范畴，在细胞薄片培养与收获的过程中接触的PIPAAm也具有良好的生物相容性[37]，结合以上优势，细胞薄片植入体内后不会有感染的风险。利用人体自身细胞所形成的细胞薄片，更是排除了异体排斥反应的可能性。

3.4 内镜黏膜下剥离术(ESD)治疗后食管重建

ESD切除浅表食管肿瘤正变得越来越普遍，然而大规模的食管ESD通常需要随后的多次球囊扩张来预防术后食管狭窄，因此有研究提出使用内镜下组织工程化自体口腔黏膜上皮细胞片移植预防ESD后食管狭窄的形成，即将黏膜上皮细胞移植到ESD导致的溃疡创面上[38]。细胞薄片可以很容易地黏附到移植部位，无需缝合或使用其他黏合剂，而且自体口腔黏膜上皮细胞薄片移植可以促进切除区域的上皮化以及防止食管狭窄。另外，移植的细胞薄片除了具有旁分泌作用外，还可以作为细胞来源促进组织再生。已有临床研究[39]显示,移植细胞薄片后食管溃疡部位早期再上皮化并且食管狭窄情况减少。

3.5 牙周膜再生

牙周韧带(PDL)作为连接牙齿和牙槽骨的支撑组织起着重要的作用，PDL来源的细胞在骨诱导培养基中具有诱导牙骨质形成的能力，因此从PDL中获取的细胞具有再生牙周组织和牙骨质的能力。在犬类模型中，PDL细胞薄片促进了牙槽骨和牙骨质的再生[10]。在一项人类临床研究中，从智齿中获得PDL细胞，通过降低温度至20 ℃可以收获用TRCD培养的PDL细胞薄片，为了提供大量的细胞，通常在骨下缺损附近植入3层细胞薄片，细胞薄片疗法在牙周膜再生方面的安全性和有效性已在9例病例中得到证实[40]。

3.6 用于肾脏再生的细胞薄片组织工程技术

已有研究[41]报道人类肝细胞生长因子(HGF)转基因间皮细胞片作为大鼠肾纤维化模型治疗单侧输尿管梗阻(UUO)的方法，将使用分泌HGF的细胞薄片的治疗效果与非转基因间皮细胞片和HGF静脉内给药(对照组)进行了比较，与对照组相比，在UUO大鼠中，分泌HGF的细胞层显著抑制了肾纤维化，这就支持了细胞薄片在传递分泌HGF的细胞以及使细胞在植入组织局部后持续地分泌HGF抑制肾纤维化方面的价值。此外，研究人员[42]在体外将能够分泌重要的HGF和VEGF的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)片直接移植到大鼠肾脏缺血再灌注模型的肾脏表面，将使用BMSC片的治疗效果与静脉注射悬浮的BMSC进行了比较，结果发现移植细胞以BMSC细胞薄片的形式输送比静脉注射悬浮细胞的保留时间更长，并且BMSC细胞薄片保护了整个肾脏的微血管密度，抑制了肾功能障碍。

4 组织工程细胞薄片在临床研究中存在的问题

4.1 种子细胞的选择

作为一种新兴的细胞疗法，选择合适的种子细胞是细胞薄片组织工程的前提。为了避免异体细胞导致的排斥反应应尽量采取自体细胞，且获取该细胞对人体创伤较小，比如通过口腔黏膜上皮细胞活检获取的种子细胞[43]。近年来随着对干细胞的研究越来越深入，也为选择种子细胞提供了新的参考和方向。iPSCs作为干细胞技术的一种，与经典的胚胎干细胞和体细胞核移植技术不同，iPSCs技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此不会涉及到伦理问题。此外，利用iPSCs技术可以用病人自己的体细胞制备专有的干细胞，从而大大降低了免疫排斥反应发生的可能性。Nagamoto等[23]利用iPSCs来源的肝细胞薄片治疗急性肝衰竭小鼠，Mandai等[44]利用iPSCs诱导的视网膜细胞来治疗黄斑变性。

4.2 组织血管化的形成

如何建立功能化的血管通道仍是细胞薄片组织工程面临的一个关键问题[45]，大部分正常组织中，由于氧气和其他营养元素在组织中被动扩散所能达到的极限大约在100 μm，因此细胞与毛细血管的距离都在100 μm以内，而细胞薄片虽然能制造出多层三维结构组织，但仍不能摆脱这一限制。Sakai等[46]通过将肝细胞和成纤维细胞共培养获得肝细胞/成纤维细胞细胞薄片，将该细胞薄片移植入小鼠皮下获得血管化皮下人肝组织。Shimizu等[47]通过多次手术来解决这个限制，首先移植3层细胞薄片进入目标组织，间隔1 d使原部位的毛细血管生长入细胞薄片结构内，接着再植入3层细胞薄片于原移植部位上并重复该步骤，以此获得了1 mm厚度且具有新生毛细血管网的三维细胞薄片组织。因此，如何构建具有血管功能性的细胞薄片仍是细胞薄片工程在临床应用上的一个难点。

4.3 细胞薄片的力学性能

目前已能构建具有一定功能与结构的细胞薄片，但在薄片强度方面仍存在不足，在重建一些较高强度的器官如骨、血管和筋膜等仍受到限制。为解决这一限制，Ayala等[48]通过将人间充质干细胞细胞薄片与可在人体内降解的藻酸盐凝胶相结合植入全层腹壁缺损大鼠体内，8周后发现大鼠疝气的复发得到了阻止，并且形成了新的组织和血管网络。因此，对于增加细胞薄片的强度和力学性能的方法还需要进一步发掘和优化。

4.4 细胞薄片的制备到临床应用

基于细胞薄片的临床应用目前已取得巨大进展，细胞薄片在多种疾病的治疗中均有显著的疗效。细胞薄片从制备到应用最关键的一步即为TRCD的构建，为了实现细胞薄片在临床治疗中的广泛应用，应大规模构建TRCD，但纳米级的接枝厚度在便于细胞薄片收获的同时也限制了TRCD的构建。因此，细胞薄片的大规模制备是临床治疗应用中一个亟需解决的问题。

5 总结与展望

细胞薄片组织工程技术在再生医学和组织建模上与目前临床常用的细胞疗法相比，已有其独特的特征和优势(表1)。纳米级的PIPAAm为培养底物提供了热响应特性，这就可以通过温度来调节细胞的黏附和分离。重要的是，这些细胞薄片可以保留完整的细胞间连接和相关的ECM。基于这些性质，细胞薄片疗法可以将各种治疗细胞输送到受损部位，并已在一些人类临床研究中应用。除了已有的人类临床研究，细胞薄片技术的进步有望再拓宽再生医学的应用领域，并且使我们能够生产出用于治疗难治性疾病的人类细胞组织模型。因此，细胞薄片组织工程良好的应用前景值得期待。

表1 3种疗法情况介绍