纳米银对猪链球菌体外抗菌活性及其生物膜形成的影响

刘宝玲，李春玲，蒋智勇，杨冬霞，张昆丽，楚品品，勾红潮，蔡汝健

(1.广东省农业科学院动物卫生研究所，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广州 510640；2.仲恺农业工程学院动物科技学院，广州 510225)

猪链球菌(Streptococcussuis，S.suis)是一种重要的人兽共患病病原菌，呈世界性流行，对养猪行业和公共卫生安全造成重大的威胁。近年来，猪链球菌的耐药性日渐严重甚至出现多重耐药现象，给临床治疗带来了巨大困难。猪链球菌具有生物膜形成能力，可引起急慢性感染。生物膜是猪链球菌重要的生理保护屏障之一，它能够通过阻碍药物渗透而抑制杀菌作用，并且增强细菌对抗生素的耐药性[1-2]。张丽蓉等[3]将形成生物膜的鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌与游离菌对消毒剂的抗性进行对比研究，发现游离菌均比形成生物膜的细菌的抗菌性要低，即这三类菌形成生物膜后耐药性均增强。形成生物膜的细菌的耐药性远高于浮游态细菌，能够抵抗百倍以上正常药物剂量，从而给临床治疗带来了极大挑战。

纳米银(silver nanoparticles，AgNPs)是近年来新研发的抗菌材料，具有独特的抗菌性能，在一些细菌上表现出明显的抗菌、抗生物膜形成的效果。目前，AgNPs被认为是抗生素潜在的替代品，在解决细菌耐药性问题上有很大的潜力[4]。据报道，AgNPs能有效对抗多重耐药沙门氏菌，并且在体内外均无不良影响[5]；Estevez等[6]研究表明，AgNPs粒子对大肠杆菌和白色念珠菌都有抗菌效果，并且对其产生的生物膜具有清除作用，尤其是能使白色念珠菌生物膜的形成量减少80%。Liao等[7]报道了AgNPs对多重耐药的铜绿假单胞菌具有高度杀菌作用。Yuan等[8]检测AgNPs对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌多重耐药菌株的影响，发现AgNPs可以诱导细菌细胞死亡。

研究AgNPs对多重耐药猪链球菌的抗菌活性及其生物膜形成影响，对解决猪链球菌的耐药问题具有重要意义。因此，本研究以临床分离的多重耐药猪链球菌为试验菌，探究AgNPs对其活性及生物膜形成的影响，以期为开发防治猪链球菌病的新型药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 5株猪链球菌分离株均由广东省农业科学院动物卫生研究所猪病研究室分离鉴定和保存，其耐药情况如表1所示。

表1 各菌株的耐药情况

1.1.2 主要试剂及仪器 AgNPs原液(棕色水溶液，浓度：30 000 μg/mL，粒径大小：5～7 nm，密度：1.01 g/cm3，pH：8)购自广东顺德正善川生物科技有限公司；大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)购自广东环凯微生物技术有限公司；结晶紫溶液购自雷根生物技术有限公司。酶标仪(Bio Tek Epoch 2)购自伯腾仪器有限公司；恒温箱(PYX-DHS500)购自上海跃进医疗器械厂；恒温振荡培养箱(ZWYR-2101C)购自上海智城分析仪器制造有限公司；紫外分光光度计(SPECORD 200 PLUS)购买自耶拿分析仪器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养 取冻存的菌株解冻后接种于TSA琼脂平板中，于37 ℃恒温箱中培养24 h，挑取单个菌落接种于TSB培养基中，置于37 ℃恒温培养箱中振荡培养8 h，采用平板计数法测定细菌浓度，并将菌液保存备用。

1.2.2 AgNPs对猪链球菌最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定 参考Swolana等[9]方法并做一些调整，采用微量肉汤稀释法，将AgNPs用TSB倍比稀释，依次加入96孔板中，每孔100 μL，参考于文会等[10]方法，将1.2.1中的菌液浓度调整到1.0×106CFU/mL，每孔加入100 μL，使菌液的终浓度为5.0×105CFU/mL。每个板上均设置阳性对照及阴性对照。放入培养箱中，37 ℃培养24 h，以肉眼观察，无菌体生长的最低浓度孔即为AgNPs对猪链球菌的MIC。从MIC终点孔到第1孔中分别吸取50 μL菌接种于TSB平板上，37 ℃培养箱中孵育24 h，接种平板中未见菌体生长的最低药物浓度为AgNPs对猪链球菌的MBC。

1.2.3 AgNPs对猪链球菌抑制率的影响 将猪链球菌接种于含TSB的96孔板中，加入不同浓度的AgNPs溶液，使菌液的终浓度为1.0×106CFU/mL，试验组将100 μg/mL AgNPs进行2倍倍比稀释至0.098 μg/mL，对照组不加AgNPs，置于37 ℃的恒温培养箱中培养24 h，然后用紫外分光光度计测定D600 nm值，并根据公式计算抑制率[5]。

抑制率(%)=

1.2.4 AgNPs对猪链球菌生长速率的影响 将1.2.1中的菌液接种到TSB培养基中，每个菌株分别加入终浓度为1/2MIC、MIC、2MIC的AgNPs溶液，阴性对照不加AgNPs，置于37 ℃培养箱中振荡培养，0～6 h每1 h取样，之后每2 h取样，取样至12 h，用紫外分光光度计测定D600 nm值，按照公式计算菌株的生长速率[11]并绘制曲线。

式中，C0和C1分别代表初始和最终吸光度；t0和t1分别表示初始和结束时间。

1.2.5 猪链球菌生物膜形成能力测定 参考Stepanovic等[12]方法及判定标准测定5个菌株生物膜的形成能力。在含有180 μL TSB的96孔板中，接种20 μL 1.2.1中的菌液，阴性对照只加200 μL TSB不加菌液，每个待测菌株设置3个孔，阴性对照6个孔，将培养板置于37 ℃培养箱中培养24 h后进行结晶紫染色。弃掉培养基，每孔加入300 μL的PBS清洗3次，倒置排水，然后加入150 μL甲醇固定20 min后弃液，倒置干燥，随后加入150 μL结晶紫溶液染色15 min，吸出液体后洗涤至没有污渍，干燥后加入150 μL乙酸(33%)洗脱30 min以上，用紫外分光光度计测定D570 nm值。

根据生物膜形成的判定标准[12]计算临界值(DC)。DC=阴性对照的平均D570 nm+3×阴性对照标准差，以各菌株的D570 nm-DC判定是否形成生物膜，正值表示形成生物膜。

1.2.6 AgNPs对猪链球菌生物膜形成的影响 根据1.2.5所述检测生物膜的方法略做调整测定猪链球菌在AgNPs的作用下生物膜的形成能力。各待测菌液分别加入AgNPs溶液，使AgNPs终浓度分别为50、25、12.5和6.25 μg/mL，对照组为不加AgNPs的菌液，另外设置加AgNPs的空白培养基为空白对照，于37 ℃静置培养24 h后进行结晶紫染色，操作如1.2.5所述，用紫外分光光度计测定各孔D570 nm值，根据吸光度结果分析AgNPs对猪链球菌生物膜的形成的影响。形成率按以下公式计算：

1.3 数据统计与分析

试验数据用GraphPad Prism 8.0进行单因素方差分析，结果用平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 AgNPs对猪链球菌的MIC和MBC

通过微量肉汤稀释法测定了AgNPs对S1018、S894、S786、S815和S844 5株猪链球菌的MIC分别为12.5、25.0、25.0、25.0和25.0 μg/mL，MBC分别为12.5、25.0、25.0、25.0和25.0 μg/mL(表2)。AgNPs对不同分离株的MBC/MIC比率显示抑菌和杀菌作用不同，AgNPs对5株菌的MBC/MIC值均为1，表明AgNPs是猪链球菌的一种杀菌剂，对猪链球菌有强烈的杀菌作用。

表2 AgNPs对5株猪链球菌的MIC和MBC值

2.2 AgNPs对猪链球菌的抑制效果

由图1可知，25～100 μg/mL AgNPs对5株菌的抑制率均达到96.60%以上，最高可达到99.70%，12.5 μg/mL AgNPs对S1018的抑制率仍有98.40%，菌株S894和S786对各浓度AgNPs均保持相对较高的敏感性。0.098 μg/mL AgNPs对菌株S894和S786抑制率分别为59.32%和35.18%。

2.3 AgNPs对猪链球菌生长速率的影响

由图2可知，与阴性对照组相比，不同浓度AgNPs对不同菌株的生长速率均有影响，各菌株在1/2MIC、1MIC和2MIC AgNPs浓度下细菌生长明显受到抑制。

2.4 猪链球菌生物膜的形成能力

经测定并计算，临界值DC=0.13，各菌株的平均D570 nm值均>DC，S1018菌株的D570 nm值显著高于DC值(P<0.05)，S894、S786、S844、S815菌株的D570 nm值显著高于DC值(P<0.01)(图3)，因此5个菌株均具有生物膜形成能力，形成能力大小顺序为：S786>S815>S894>S844>S1018。

2.5 AgNPs对猪链球菌生物膜形成的影响

由图4可知，在50、25、12.5和6.25 μg/mL AgNPs的作用下，5株猪链球菌生物膜的形成率均存在不同程度的降低，其中，AgNPs对菌株S786、S844和S815的生物膜形成率的下降呈现剂量依赖性。5个菌株中，菌株S786的生物膜形成率在各浓度组均为最低，形成率最低为54.42%，即抑制率最高为45.58%。菌株S1018的生物膜形成率在各浓度组均为最高，形成率最高为82.02%，即抑制率最低为17.98%，5个菌株中各浓度组与0 μg/mL AgNPs组相比，均差异极显著(P<0.01)。

A～E，分别为菌株S1018、S894、S786、S844和S815。图2、4同A-E,Strains of S1018,S894,S786,S844 and S815,respectively.The same as fig.2 and fig.4图1 不同浓度AgNPs对猪链球菌的抑制率Fig.1 Inhibition rate of different concentrations of AgNPs on Streptococcus suis

图2 不同AgNPs浓度组猪链球菌的生长速率曲线Fig.2 Growth rate curve of Streptococcus suis in different concentration AgNPs groups

与DC相比，*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)Compared with DC,*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01)图3 猪链球菌的生物膜形成能力Fig.3 The ability of biofilm formation of Streptococcus suis

与0 μg/mL AgNPs组相比，*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)Compared with 0 μg/mL AgNPs group, *, Significant difference (P<0.05), **, Extremely significant difference (P<0.01)图4 不同AgNPs浓度组猪链球菌生物膜的形成率Fig.4 Biofilm formation rate of Streptococcus suis in different concentration AgNPs groups

3 讨 论

猪链球菌的耐药情况国内外均有报道，其日渐加重的耐药性是对医疗卫生和疾病防控重要的威胁，多重耐药菌及生物膜感染已经成为传染病中日益突出的问题，致使临床可用药物的数量减少，甚至出现无药可用的现象。因此，许多研究者都在寻找对抗病原的抗生素替代物，随着AgNPs在医学和生物技术各个领域的应用逐渐广泛，AgNPs的抗菌效果也逐渐受到重视。许多研究表明，AgNPs对不同的病原体都具有明显的抑菌作用，如沙门氏菌[5]、大肠杆菌[6]、铜绿假单胞菌[7]、硝化细菌[13]和金黄色葡萄球菌[14]等。

MBC/MIC表示药物对细菌的抑菌和杀菌效果，当MBC/MIC≥32时，细菌对该药物具有耐受性[15]。本研究结果显示，AgNPs对5株多重耐药猪链球菌的MBC/MIC均为1，表明AgNPs对它们均具有较强的杀灭作用。浓度在0.098～100 μg/mL之间的AgNPs对猪链球菌均具有抑制效果，浓度在25～100 μg/mL时对5株菌的抑制率可达到96.60%～99.70%，菌株S786、S894和S815在各浓度下都保持相对较高的敏感性，这可能是由于这3株菌的生物膜形成能力相对较好，AgNPs在生物膜中的积累所致，与Swolana等[9]研究结果相似。 除此之外，AgNPs能够明显降低猪链球菌的生长速率，减少细菌的繁殖，与于晓旭等[16]研究结果相似。

生物膜的形成可能会增强猪链球菌的毒性、耐药性以及逆境中的生存能力，有效抑制生物膜的形成将有助于减小猪链球菌的生存能力和感染力。本试验结果表明，选用的5株多重耐药猪链球菌临床分离株均可形成不同程度的生物膜；AgNPs对5株猪链球菌生物膜的形成均有抑制效果，在5个菌株中，AgNPs的4个测试浓度对菌株S786生物膜的形成抑制率均为最高，最高可达45.58%，对菌株S1018生物膜形成的抑制率均为最低，最低为17.98%，这可能与各菌株生物膜形成能力的差异以及各菌株对AgNPs的敏感性的差异有关，其具体机制需要进一步探讨。AgNPs的抗菌抗生物膜形成的机制是复杂的，包括影响呼吸链、抑制相关基因的表达、抑制相关蛋白的表达、影响DNA的合成及阻止细菌的黏附等[17-20]。在后续的研究中，将基于AgNPs对猪链球菌生物膜的抑制效果，进一步研究AgNPs抗菌和抗生物膜形成的相关机制。

AgNPs的抗菌作用已经得到广泛的证实[21]，但AgNPs的生物安全性仍存在争议，贾建博[22]研究表明AgNPs会在超重小鼠的肝脏积累并促进肝脏病变，但Farouk等[5]研究显示AgNPs在小鼠体内外均无不良影响。这可能与不同研究中所采用AgNPs的颗粒大小、形态、剂量以及试验动物等各方面因素不同有关。本试验结果表明，AgNPs对体外猪链球菌具有较好的抗菌活性，对猪链球菌生物膜的形成有抑制作用，后续将开展AgNPs的动物体内毒性和抗菌活性方面的研究，以期为开发新型抗菌药物提供理论依据。

4 结 论

本研究结果表明，AgNPs对多重耐药猪链球菌的抗菌活性好，25～100 μg/mL AgNPs对5株菌的抑制率可达96.60%～99.70%，6.25、12.5、25和50 μg/mL AgNPs对多重耐药猪链球菌菌株生物膜形成抑制率最高为45.58%，最低为17.98%，本研究结果可为开发新型抗菌药物奠定基础。