PCV3对仔猪生长相关激素及其功能基因表达的影响

孙庆帅，严伟东，李 畅，吴 昊，李长春，何启盖

(1.华中农业大学动物科技学院/动物医学院，武汉 430070；2.华中农业大学,农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070；3.华中农业大学动物科技学院,农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070；4.武汉科前生物股份有限公司，武汉 430072)

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是目前发现的最小的一种DNA病毒，病毒颗粒直径约为17 nm[1]，目前主要存在4种基因型，包括非致病性的PCV1、致病性的PCV2和PCV3[2]及2020年Zhang等[3]在湖南省发现的PCV4。当前影响生猪养殖的主要为PCV2，且PCV2通常会伴随猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪细小病毒(Porcine parvovirus virus，PPV)混合感染[4]。PCV2感染可导致保育期仔猪断奶多系统衰竭综合征(PMWS)和猪皮炎肾病综合征(PDNS)，还可引起猪的呼吸道疾病综合征及生长缓慢[5]。 PCV3是一种与PDNS样临床疾病、繁殖障碍和多系统炎症相关的病原体[6-7]。 PCV3是具有2 000个核苷酸的环状基因组，主要包含3个开放阅读框(ORF)[8]，编码复制酶和衣壳蛋白的2个ORFs与蝙蝠圆环病毒蛋白的相似性分别为55%和35%，与PCV1和PCV2的相似性为31%～48%，表明PCV3与之前报道的圆环病毒不同[9]。

国内外均有仔猪感染PCV3导致体重减轻、消瘦[10-14]的报道，对养殖业造成严重经济损失，但目前对仔猪感染PCV3后出现消瘦、体重减轻是否与生长相关激素以及生长相关功能基因变化有关的研究报道甚少。肝脏是机体重要的新陈代谢器官，对机体生长发育有着重要的调节作用；脾脏是机体重要的免疫器官，具有过滤血、造血以及储血的功能，其正常发育、成熟才能使动物发挥相应的生理功能，对维持仔猪健康具有重要作用。本试验对仔猪人工感染PCV3后不同时间点血清中三碘甲状腺源氨酸(T3)、甲状腺素(T4)水平，以及肝脏、脾脏、背最长肌、腿肌中生长激素受体(GHR)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)等生长相关功能基因进行检测，探究仔猪感染PCV3后生长相关激素及生长相关功能基因的变化，以期为进一步研究仔猪感染PCV3后导致体重减轻、消瘦的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和试验仔猪 PCV3由武汉科前生物公司分离并保存，第15代PCV3-HK株(109拷贝/mL，GenBank登录号：MW767462)；8头试验仔猪均购自于湖北金林原种畜牧有限公司，体重均在6.93 kg左右，无PCV2、PCV3、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)病原感染。

1.1.2 主要试剂及仪器 DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；猪T3、T4试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；NucleoZOL购自MACHEREY-NAGEL公司；RNA反转录酶购自TaKaRa公司；SYBR Green Master Mix购自武汉Yeasen公司；DMEM购自Gibco公司。荧光定量PCR仪(CFX96TM)购自Bio-Rad公司；超微量分光光度计(NanoDrop 2000c)购自ThermoFisher Scientific公司；多功能酶标仪购自Tecan公司；离心机购自Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 将8头仔猪随机均分为2组:PCV3感染组(感染组)、DMEM组，各组之间相互隔离，仔猪自由采食。病毒液、DMEM均从颈部肌肉两侧注射1 mL。

1.2.2 仔猪体重及平均日增重测定 于攻毒前0 d(攻毒之前)及攻毒后3、7、14、21 d分别称重，试验结束后计算各组仔猪平均日增重。

1.2.3 探针/引物设计及合成 根据GenBank上PCV3基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计PCV3-Probe探针和PCV3基因引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。根据GenBank中GHR、IGF-1、IGF-1R基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所有引物的具体信息见表1。

表1 引物和探针信息

1.2.4 仔猪病毒载量测定 采集仔猪的口腔拭子、鼻腔拭子、肛门拭子及血液，分离出血清后分为2份,于-80 ℃保存，1份用于检测病毒载量，1份用于T3、T4检测。按照核酸提取试剂盒说明书提取口腔拭子、鼻腔拭子、肛门拭子等样品的DNA，按照李畅等[15]所建立的PCV3荧光定量方法检测病毒载量。

1.2.5 血清T3、T4浓度的检测 按照试剂盒说明书处理0、3、7、14、21 d所采集的血清，用酶标仪检测D450 nm值，并计算T3、T4的浓度。

1.2.6 组织中GHR、IGF-1、IGF-1R基因的表达量 感染病毒后第21天剖检仔猪，采集背最长肌、腿肌、脾脏、肝脏等组织，按照NucleoZOL说明书提取组织样品总RNA，取2 μL总RNA用超微量分光光度计测定浓度，检验RNA质量，并将RNA浓度控制加样量在1 000 ng。以GAPDH为内参基因，进行实时荧光定量PCR。 PCR反应体系20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。

1.3 数据统计与分析

生长相关功能基因的mRNA相对表达量用2-△△Ct法进行计算，用IBM SPSS Statistics 21.0软件独立样本t检验进行差异分析，结果用平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 仔猪体重及平均日增重

试验期间，PCV3感染组仔猪眼观可见消瘦、被毛粗乱。2组仔猪初始体重差异不显著(P>0.05)，感染组仔猪终末体重、平均日增重均极显著低于DMEM组仔猪(P<0.01，表2)。

表2 各组仔猪体重及平均日增重

2.2 仔猪的病毒载量

各样品的病毒载量检测结果显示，DMEM组未检测到PCV3，PCV3感染组仔猪口腔拭子、鼻腔拭子、肛门拭子和血清的病毒载量在攻毒后第3天均可以检测到，并在第14天达到最高，第14～21天快速下降(图1)。

图1 口腔(A)、鼻腔(B)、肛门(C)拭子以及血清(D)中病毒载量Fig.1 Viral load in oral (A),nasal (B),anal (C) swabs and serum (D)

2.3 血清中T3、T4浓度

PCV3感染前后不同时间段血清中T3、T4表达水平测定结果显示，感染后第14和21天感染组仔猪血清中T3表达量极显著高于DMEM组(P<0.01)，在感染的第3和7天差异不显著(P>0.05)；2组之间T4表达量在感染后所有时间差异均不显著(P>0.05)(图2)。

2.4 各组织中GHR、IGF-1、IGF-1R基因的表达量

实时荧光定量PCR检测结果显示，PCV3感染组背最长肌中IGF-1的mRNA相对表达量极显著低于DMEM组(P<0.01)，2组间GHR和IGF-1R基因的相对表达量差异不显著(P>0.05)；2组的腿肌和脾脏中GHR、IGF-1、IGF-1R基因的相对表达量均无显著差异(P>0.05)；PCV3感染组肝脏中GHR基因mRNA相对表达量极显著高于DMEM组(P<0.01)，IGF-1R基因mRNA相对表达量显著高于DMEM组(P<0.05)，2组之间IGF-1基因mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)(图3)。

*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)；无*，差异不显著(P>0.05)。下同*,Significant difference(P<0.05)；**，Extremely significant difference(P<0.01)；No *,No significant difference(P>0.05).The same as below图2 各组血清中T3(A)、T4(B)浓度Fig.2 Concentration of T3(A) and T4(B) of serum in each group

A～D，分别代表背最长肌、腿肌、脾脏和肝脏A-D，Back muscle,leg muscle,spleen and liver,respevtively图3 各组不同组织中生长相关功能基因mRNA相对表达量Fig.3 mRNA relative expression of growth-related functional genes of different tissues in each group

3 讨 论

目前针对PCV3的研究主要集中在病毒分子特征、跨物种传播、流行病学调查、发病机理、检测技术等方面[16]，对仔猪感染PCV3后导致的体重减轻、消瘦研究较少。本研究中，PCV3感染组注射病毒液后第3、7、14、21天的口腔拭子、鼻腔拭子、肛拭子以及血清中均可检测到PCV3，且病毒载量均在第14天达到最高；PCV3感染组仔猪在饲养阶段可发现消瘦、被毛粗乱，且PCV3感染组仔猪末重与平均日增重均极显著低于DMEM组。而在汪孟航[17]用PCV3-DB-1毒株进行的3周龄仔猪攻毒试验中，仔猪在感染后的第14天才在血清中检测到PCV3，并在第28天时病毒载量达到最高，各组仔猪表现无异常情况，体重差异不显著；Hou等[18]研究发现，PCV3感染改变了肠道微生物群的多样性和组成，最终导致严重的体重减轻和炎症反应；Jiang等[19]研究发现，仔猪感染PCV3后也导致明显的体重减轻。本研究与汪孟航[17]的研究结果有一定差异，但与Hou等[18]、Jiang等[19]研究结果PCV3感染可造成仔猪体重减轻、消瘦的情况相同，原因可能是毒株的致病力以及试验的温度、湿度等不同而造成的。

甲状腺功能亢进是一种甲状腺合成和分泌过量甲状腺激素造成的疾病，会引起T4或T3升高或两者都升高[20]，通常的症状是心悸、疲劳、体重减轻、四肢震颤和体重减轻[21-23]。甲状腺激素几乎作用于所有有核细胞，对生长、神经元发育、生殖和能量代谢的调节至关重要[24-25]，能够促进机体能量吸收和糖原分解，是维持机体正常代谢的重要激素。本研究发现，仔猪感染PCV3后在排毒量达到最高的第14天后，T3含量极显著上升，T4含量无显著变化，表明PCV3感染会引起仔猪甲状腺机能亢进，导致体内代谢加快。

GHR属于第1类生长因子受体家族蛋白，作为细胞膜中构成型二聚体存在，介导生长激素发挥作用，是生长激素(GH)的受体，GHR结合GH后，对机体发挥广泛的作用，包括促进生长、细胞分裂和细胞再生方面，并影响碳水化合物、脂质和蛋白质的代谢[26]。IGF-1是一种具有类似于胰岛素原氨基酸序列的类胰岛素肽，被认为是GH作用的主要中介物。 IGF-1R具有抗凋亡和促进有丝分裂的功能[27]，其基因表达的调控包括转录和转录后水平的调控[28]。也有研究提出，GHR、IGF-1、IGF-1R的过量可能导致过度增长、肥大以及代谢异常，导致如肢端肥大症、癌症等[29-30]。本研究发现，仔猪感染PCV3后，肝脏中的GHR mRNA相对表达量极显著高于对照组，IGF-1R的mRNA相对表达量显著高于对照组，表明PCV3可造成肝脏代谢异常，而背最长肌中IGF-1表达量显著降低，表明仔猪感染PCV3后可使背最长肌中IGF-1表达量降低，影响背最长肌发育。

4 结 论

本研究结果显示，PCV3感染仔猪后可导致平均日增重降低、机体消瘦，血清T3的表达量升高，肝脏中GHR、IGF-1R mRNA相对表达量升高，背最长肌中IGF-1 mRNA相对表达量降低。说明仔猪感染PCV3后，甲状腺机能亢进，导致体内代谢加快，造成机体对碳水化合物、脂质和蛋白质等的分解代谢加快，降低GH对背最长肌的促生长、促细胞分裂作用，从而导致仔猪消瘦。