小檗碱对黄羽肉鸡器官指数、抗氧化能力和肠道免疫功能的影响

朱 翠，黄凯勇，李丽娜，吴爱基，吴 鹏，符芳苗，罗苑华，张辉华

(佛山科学技术学院生命科学与工程学院，佛山 528225)

长期使用抗生素会导致细菌耐药性增加、药物残留和环境污染等问题，最终危害动物和人类健康，因此寻找合适的抗生素替代品迫在眉睫。中草药与植物提取物被认为是绿色、安全、无污染的饲料添加剂，具有促进畜禽生长、改善肠道健康、提高繁殖性能和调节免疫功能等作用[1]。小檗碱(berberine，BBR)又称黄连素，是黄连、黄柏、三颗针等传统中药的主要有效成分，具有抗菌、抗氧化、抑菌、消炎、降血糖、降脂和抗凋亡等生理功效，在临床上已广泛用于治疗腹泻、胃肠炎与心血管疾病等[2-3]。研究表明，三颗针提取物(主要成分为小檗碱)可代替阿维拉霉素促进肉仔鸡生长发育，提高肉仔鸡机体的抗氧化能力和抗体水平[4-5]。本课题组前期研究也发现，在饲粮中添加250 mg/kg的小檗碱可显著提高黄羽肉鸡的生长性能，调节盲肠微生物结构和多样性[6]。此外，在小鼠的研究表明，小檗碱具有较强的免疫调节作用，可以减少机体炎性因子的表达，从而减轻肠道和肺部炎症损伤[7]。但是，小檗碱作为抗生素替代品在改善黄羽肉鸡的器官发育、肠道抗氧化和免疫功能的作用研究相对较少。本研究在研究饲粮中添加小檗碱对黄羽肉鸡器官指数、抗氧化能力和肠道免疫功能的影响，以期为小檗碱在肉鸡生产中的合理应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲粮

试验选取1日龄健康快大型岭南黄羽肉鸡 360只，按单因子随机分组设计分为3组，即对照组(NC)、抗生素组(PC)和小檗碱组(BBR)，每组6个重复，每个重复20只鸡。试验采用玉米-豆粕型基础饲粮，根据《鸡饲养标准》(NY/T33-2004)[8]和《中国饲料成分及营养价值表》(2019年第30版)进行配制[9]。 基础饲粮组成及营养水平见表1。 对照组饲喂基础饲粮；抗生素组饲喂基础饲粮+200 mg/kg土霉素钙和250 mg/kg那西肽(土霉素钙和那西肽由佛山市广牧兴饲料有限公司提供)；小檗碱组饲喂基础饲粮+250 mg/kg小檗碱(购自陕西森弗天然制品有限公司)。

表1 基础饲粮组成与营养水平(干物质基础)

1.2 主要试剂和仪器

总抗氧能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；PrimerScriptTMRT Reagent Kit购自TaKaRA公司；荧光定量PCR mix试剂盒购自Bio-Rad公司。酶标仪(INFINITE M PLEX)购自TACAN公司；核酸蛋白检测仪(Nanodrop ND-1000)购自Thermos Scientific公司；实时荧光定量PCR仪(CFX96 Real-time PCR System)购自Bio-Rad公司。

1.3 饲养管理与屠宰采样

饲养试验共63 d，分为小鸡(1～21 d)、中鸡(22～42 d)和大鸡(43～63 d)3个阶段。试验鸡笼养，试验期间自由采食与饮水。在试验第21、42和63天，每个重复挑选1只接近平均体重的鸡屠宰，采集其空肠中段组织，用玻片在冰上轻轻刮取空肠黏膜，分装于1.5 mL离心管中，速冻于液氮，然后转置于-80 ℃保存待测。

1.4 器官指数

肉鸡21、42和63日龄屠宰后测定屠体重，采集心脏、肝脏、脾脏和法氏囊分别称重，计算其器官指数，具体公式为：器官指数(%)=(器官重量/屠体重)×100。

1.5 抗氧化指标

取63日龄时的空肠黏膜样品1 g，加入0.9%生理盐水，用组织捣碎机研磨制成10%空肠黏膜匀浆液，3 500 r/min离心15 min，取上清。测定空肠黏膜匀浆液的抗氧化指标，包括总抗氧能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量，具体步骤按照相应试剂盒方法进行。

1.6 肠道紧密连接蛋白和肠道免疫相关基因的mRNA表达量

1.6.1 空肠黏膜总RNA的提取和cDNA合成 取21、42和63日龄黄羽肉鸡的空肠黏膜组织各0.1 g，按Trizol法提取总RNA，用NanoDrop ND-1000核酸蛋白检测仪测定样品在260和280 nm处的吸光值，检测样品浓度和纯度；通过1.0%琼脂糖凝胶电泳(150 V，20 min)检测其完整性。以总RNA浓度为1 μg/mL进行反转录合成cDNA，反转录参考反转录酶试剂盒的使用说明进行，cDNA样品置于-20 ℃保存。

1.6.2 引物设计与合成 参照NCBI网站GenBank中跨膜蛋白-1(Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、IL-8、IL-10、核苷酸结合寡聚化结构域蛋白1(NOD1)、Toll样受体4(TLR4)、分泌型IgA(sIgA)、肌动蛋白(β-actin)基因的序列，使用Prime Premier 5.0软件，设计目的基因上、下游引物(表2)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。合成后的引物用0.1%的DEPC水稀释到100 μmol/L，于-20 ℃保存备用。

表2 引物信息

1.6.3 实时荧光定量PCR 以合成的cDNA为模板，将各组分按总体系20 μL加入到96孔板中：SYBR Green (2×) 10 μL、上、下游引物 (终浓度为10 μmol/L) 各1 μL、cDNA模板1 μL、DEPC水8 μL；封膜，3 000 r/min快速离心1 min，使各组分集于孔底，置于荧光定量PCR仪中进行扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃终延伸10 min。熔解曲线的反应条件为：95 ℃ 5 s，65 ℃ 60 s，95 ℃ 30 s，每个样品3个重复，采用2-ΔΔCt方法计算目的基因相对表达量，即ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，ΔΔCt=ΔCt(处理组)-ΔCt(对照组)。

1.7 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan氏多重比较检验，结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著，0.05

2 结 果

2.1 饲粮添加小檗碱对黄羽肉鸡器官指数的影响

由表3可知，在饲粮中添加小檗碱或抗生素对21、42和63日龄黄羽肉鸡的法氏囊指数、脾脏指数、心脏指数与肝脏指数均无显著影响(P>0.05)。与对照组和小檗碱组相比，抗生素组63日龄黄羽肉鸡的脾脏指数有提高趋势(0.05

表3 各组黄羽肉鸡器官指数测定结果

2.2 小檗碱对黄羽肉鸡肠道抗氧化能力的影响

由表4可知，与对照组比较，在饲粮添加小檗碱显著提高了63日龄黄羽肉鸡空肠黏膜的总抗氧化能力(T-AOC)(P<0.05)，并与抗生素效果相当。 此外，与对照组和抗生素组相比，添加小檗碱显著降低了63日龄黄羽肉鸡空肠黏膜的丙二醛(MDA)含量(P<0.05)。

2.3 小檗碱对黄羽肉鸡肠道紧密连接蛋白基因mRNA表达量的影响

由表5可知，21日龄时，抗生素组黄羽肉鸡空肠黏膜Occludin和ZO-1基因mRNA表达量显著高于对照组和小檗碱组(P<0.05)，而各组间空肠黏膜Claudin-1基因的表达量无显著差异。42日龄时，与对照组相比，抗生素和小檗碱组黄羽肉鸡空肠黏膜Claudin-1、Occludin和ZO-1基因mRNA表达量均无显著差异(P>0.05)。但63日龄时，与对照组和抗生素组相比，小檗碱组黄羽肉鸡空肠黏膜Claudin-1基因mRNA表达量显著提高(P<0.05)。

表4 各组63日龄黄羽肉鸡空肠黏膜抗氧化能力测定结果

表5 各组黄羽肉鸡肠道黏膜紧密连接蛋白基因的相对表达量

2.4 小檗碱对黄羽肉鸡肠道黏膜免疫相关基因mRNA表达量的影响

由表6可知，21日龄时，与对照组和抗生素组相比，小檗碱显著降低了黄羽肉鸡空肠黏膜NOD1基因的mRNA表达量(P<0.05)；与对照组相比，抗生素处理显著提高了黄羽肉鸡空肠黏膜TLR4基因的mRNA表达量(P<0.05)；各组间空肠黏膜TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10和sIgA基因的mRNA表达量差异均不显著(P>0.05)。

42日龄时，小檗碱组与抗生素组黄羽肉鸡空肠黏膜IL-1β和IL-8基因的mRNA表达量均显著低于对照组(P<0.05)；小檗碱组NOD1的mRNA表达量显著低于抗生素组(P<0.05)，但与对照组无显著差异(P>0.05)；各组间空肠黏膜TNF-α、IL-10、TLR4和sIgA基因的mRNA表达量均无显著差异(P>0.05)。

63日龄时，与对照组相比，小檗碱显著降低了TNF-α、IL-1β、IL-8基因mRNA表达量(P<0.05)；与抗生素组相比，小檗碱显著降低了TNF-α和NOD1基因mRNA表达量(P<0.05)；各组间空肠黏膜IL-10、TLR4和sIgA基因mRNA表达量差异均不显著(P>0.05)。

表6 各组黄羽肉鸡肠道黏膜免疫相关基因的相对表达量

续表

3 讨 论

中草药添加剂是一种绿色、安全、毒副作用小、无污染的饲料添加剂，可作为畜禽机体免疫增强剂，调节机体免疫反应[1]。小檗碱亦称黄连素，是从黄连等中药中分离的一种季铵生物碱成分[10]。本课题组前期研究表明，饲粮中添加小檗碱提高了黄羽肉鸡的生长性能，且可以调控黄羽肉鸡盲肠菌群结构和多样性[6]，但对器官指数、肠道抗氧化功能和黏膜免疫功能影响尚不清楚。器官的正常发育是动物体内生理功能发挥的基础，为了满足动物机体的生理变化，动物的内脏器官与其体重会保持相对稳定的比例关系，反映器官功能与代谢强弱和免疫性能情况。研究发现，饲粮中单独添加小檗碱或同时添加连翘提取物和小檗碱，均可以显著提高白羽肉鸡的法氏囊重量及法氏囊指数[11]。而本研究发现，小檗碱或抗生素处理对21、42和63日龄黄羽肉鸡的法氏囊、脾脏、肝脏和心脏指数的影响均无显著差异，说明在本试验条件下添加小檗碱对黄羽肉鸡的器官发育无负面影响。

氧化应激是由动物机体内羟基自由基和超氧阴离子等自由基产生的一种负面影响，过量的活性氧会损伤蛋白质和核酸，并产生大量的MDA损伤组织，容易引起机体炎症与疾病。研究表明，小檗碱具有很强的清除自由基的作用，可以降低MDA含量，提高SOD和GSH-Px的活性，从而增强机体的抗氧化防御系统[12-13]。王志祥等[14]研究发现，三颗针提取物(主要成分小檗碱)可以提高仔猪的抗氧化功能，与土霉素处理相比，添加不同水平(200、500和1 000 mg/kg)三颗针提取物均显著提高了仔猪血清 GSH-Px和SOD活性，并显著降低了仔猪血清中MDA含量。研究还表明，小檗碱显著抑制了因高脂饲粮诱导的团头鲂机体氧化应激反应，提高SOD活性，同时减少细胞凋亡[15]。此外，在白羽肉鸡上的研究也显示，小檗碱组血清的T-AOC和SOD活力显著提高，而血清MDA含量则显著降低[13]。本研究在黄羽肉鸡上得到的结果与前人研究结果[11,14]一致，即饲粮中添加小檗碱能显著提高63日龄黄羽肉鸡空肠黏膜的T-AOC活力，并降低MDA含量，说明小檗碱可有效增强黄羽肉鸡的肠道抗氧化能力。

紧密连接蛋白(如Claudin-1、Occludin和ZO-1等)是肠道屏障的重要组成部分，对于维护动物肠道健康和保障机体的正常生长发育非常重要[16]。促生长类抗生素已被证实对畜禽生产性能的改善作用与其增强肠道屏障功能有关[17]。研究还显示，植物生物活性物质可通过调节紧密连接蛋白的表达量、杯状细胞数量、黏蛋白(MUC)表达量以及肠上皮通透性的变化，从而增强家禽的肠道屏障功能[18]。而本研究也表明，抗生素处理显著提高了21日龄黄羽肉鸡空肠黏膜Occludin和ZO-1基因的mRNA表达量。研究还发现，小檗碱对紧密连接蛋白表达的调节作用可能与激活磷肌球蛋白轻链激酶(MLCK)信号通路有关[19-20]。本试验则发现，饲粮添加小檗碱显著提高了63日龄黄羽肉鸡空肠黏膜Claudin-1基因mRNA表达量，说明小檗碱在改善肠道机械屏障方面具有良好作用，但是否通过激活MLCK信号通路仍需进一步研究证实。

研究表明，富含小檗碱的三颗针提取物具有和抗生素相似的抗菌和抗炎功效[21]。在断奶仔猪上的研究也显示，三颗针提取物在提高仔猪的非特异性免疫机能方面的效果要优于土霉素[13]。此外，土霉素钙与那西肽以往是肉鸡生产中常用的饲用抗生素之一，具有很好的抗菌活性[22]，可有效促进肉仔鸡的生长和增强肉仔鸡免疫机能[23]。本研究也发现，小檗碱组和抗生素组(含土霉素钙和那西肽)42日龄黄羽肉鸡空肠黏膜中炎性因子IL-1β和IL-8基因的表达量均显著降低。有研究表明，小檗碱显著降低了脂多糖(LPS)刺激的肉鸡血浆中IL-6含量，抑制了LPS刺激所引起的白细胞和淋巴数量数量增加[24]，并显著下调肉鸡肝脏中炎性因子的表达[25]，从而缓解了肉鸡的炎症反应。张光辉等[5]研究也认为，同时添加γ-氨基丁酸和三颗针提取物可以显著提高肉仔鸡的T淋巴细胞转化率，促进细胞免疫功能发育。此外，给5周龄小鼠连续8周每天灌服200 mg/kg小檗碱，其肝脏IL-1β、IL-6和TNF-α基因的表达量显著下调[26]。本研究也发现，小檗碱有效抑制了63日龄黄羽肉鸡肠道黏膜促炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-8基因的表达，这与前人研究结果[25-26]一致。

Toll样受体和NOD样受体作为病原识别受体(PRRs)在调节家禽免疫反应和疾病防治过程中发挥关键作用[27-28]。研究发现，小檗碱或二甲双胍(治疗糖尿病药物)能通过抑制TLRs/NF-κB信号通路相关基因(TLR2、TLR4、IKKα、IKBα和NF-κB)的表达，显著降低肠黏膜TNF-α的表达和血液内毒素的含量，从而缓解小鼠肠道炎症反应，保护肠道上皮完整性[29]。在大鼠上的研究也显示，小檗碱处理显著降低了回肠组织中TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6等基因的表达量，并提高了回肠MUC2和sIgA基因的表达量，从而有效缓解坏死性肠炎的损伤程度[30]。Chu等[31]也认为小檗碱通过阻断LPS与TLR4/MD2受体结合，从而抑制了下游炎症因子TNF-α、IL-8和IFN-β的表达。此外，NOD信号通路对于维持免疫稳态也具有重要作用，NOD1表达量升高已被证实与许多炎症反应及疾病密切相关[32]。 本研究也发现小檗碱显著降低了肠道黏膜中TLR4和NOD1基因的表达量，进而降低TNF-α、IL-1β和IL-8基因的表达量。可见，小檗碱具有较强的抗炎作用，可能通过抑制TLR4和NOD1信号通路下调炎症因子的表达，从而减少黄羽肉鸡肠道炎症的发生。

4 结 论

本研究表明，在无抗饲粮中添加250 mg/kg小檗碱显著提高了63日龄黄羽肉鸡肠道的抗氧化能力，并可能通过抑制肠黏膜TLR4和NOD1基因的表达，从而有效降低TNF-α、IL-1β和IL-8基因的表达，有助于减少肠道炎症的发生，维护黄羽肉鸡的肠道健康。本试验结果将为小檗碱作为抗生素替代品在改善黄羽肉鸡氧化应激和肠道健康方面的应用提供科学依据。