芦柑叶多酚超声波辅助提取工艺优化及其对亚硝酸盐的清除活性研究

苏火煌

(1.漳州职业技术学院应用化工学院，福建 漳州 363000；2.福建省精细化工应用技术协同创新中心，福建 漳州 363000)

芦柑(CitrusreticulataBlanco cv. Ponkan)，又名柑果，是福建省的优势果类之一[1-2]。目前，对芦柑的研究主要集中在果肉、果皮和果核上，而对芦柑叶研究较少[3-4]。植物的根、茎、叶中一般含有多酚、多糖、黄酮、生物碱等多种具有生物活性的天然成分。陈建福等[3]对芦柑叶中的总黄酮进行提取，发现总黄酮具有一定的抗氧化活性，是一种天然抗氧化剂。多酚也是一种具有抗自由基、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性的一类天然化合物，在食品、医药、化妆品等行业中均有广泛的应用[5-7]。

肉制品生产过程中常添加亚硝酸盐，其具有发色和抑菌作用；蔬菜储存或腌制时，在微生物的作用下也会导致亚硝酸盐的积累。亚硝酸盐的清除主要依靠酸解、酶解和还原清除等[8]。研究表明，植物中的一些天然成分能与亚硝酸盐反应，从而实现消除或降低食物中的亚硝酸含量[9-10]。目前，芦柑叶多酚提取与清除亚硝酸盐能力的研究鲜见报道。本文以芦柑叶为原料，先考察了乙醇浓度、超声时间、液料比和超声温度四个单因素对芦柑叶多酚提取率的影响，再结合响应面法对提取率工艺条件进行优化，最后考察了芦柑叶多酚对亚硝酸盐的清除能力，为芦柑叶资源开发成一种新型的天然亚硝酸盐清除剂提供了科学依据。

1 实验部分

1.1 实验材料及仪器

芦柑叶，采摘于福建省南靖县金山镇上麻村。将采摘的芦柑叶用清水清洗，去除泥沙并晾干，置于50℃干燥箱中烘干，粉碎后备用。

乙醇(食品级，河南鑫河阳酒精有限公司)；其它试剂均为分析纯。

UV-1100型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；KQ-100TDE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

采用福林-酚法[11]，在10 mL的比色管中加入一定系列体积的没食子酸标准溶液(100 mg/L)和福林-酚试剂0.5 mL，摇匀静置1 min，加入1.5 mL 20%的Na2CO3溶液，定容，在设定温度为75℃的恒温水浴锅中保温反应10 min，反应结束后，静置冷却。设置紫外可见分光光度计的吸收波长为765 nm，测反应液的吸光度。以没食子酸浓度c为横坐标，以吸光度A为纵坐标，制作标准曲线。

1.2.2 芦柑叶多酚的提取及含量测定

设置好实验所需的工艺条件，称取1 g芦柑叶粉末到圆底烧瓶中，加入一定体积和一定体积分数的乙醇溶液，后将圆底烧瓶浸入到设定好温度的超声波清洗器中，达到设定的时间后，取出冷却后过滤，定容，通过标准曲线的测定方法，计算出多酚含量，多酚提取率按下式计算：

其中，T为多酚提取率(mg/g)，b为多酚质量浓度(mg/L)，N为稀释倍数，V为提取液体积(mL)，m为芦柑叶质量(g)。

1.2.3 单因素实验设计

1.2.3.1 乙醇浓度的影响

称取1 g芦柑叶粉末到圆底烧瓶中，分别加入20 mL体积分数为50%、55%、60%、65%、70%的乙醇，在预先设置温度为60℃的超声波清洗器中浸提50 min。计算芦柑叶多酚提取率，确定最佳的乙醇浓度。

1.2.3.2 超声时间的影响

称取1 g芦柑叶粉末到圆底烧瓶中，加入20 mL 体积分数为60%的乙醇，在预先设置温度为60℃的超声波清洗器中分别浸提40、45、50、55和60 min。计算芦柑叶多酚提取率，确定最佳的超声时间。

1.2.3.3 液料比的影响

称取1 g芦柑叶粉末到圆底烧瓶中，分别加入10、15、20、25和30 mL 体积分数为60%的乙醇，在预先设置温度为60℃的超声波清洗器中浸提50 min。计算芦柑叶多酚提取率，确定最佳的液料比。

1.2.3.4 超声温度的影响

称取1 g芦柑叶粉末到圆底烧瓶中，加入20 mL体积分数为60%的乙醇，分别在预先设置温度为50、55、60、65和70℃的超声波清洗器中浸提50 min。计算芦柑叶多酚提取率，确定最佳的超声温度。

1.2.4 响应面优化试验

在单因素乙醇浓度(A)、超声时间(B)、液料比(C)、超声温度(D)对多酚提取率影响的基础上，采用Box-Behnken试验方法对各单因素进行响应面实验设计，见表1。

表1 Box-Behnken设计因素与水平表

1.2.5 芦柑叶总多酚对亚硝酸盐的清除率

在一系列25 mL的比色管中分别加入10.0 mL pH为3.0的缓冲液(柠檬酸-磷酸氢二钠)，后分别加入一系列质量浓度的芦柑叶多酚溶液(或维生素C溶液)，再加入1.0 mL 50 mg/L的NaNO2，并在37℃水浴中保温1 h，后加入2.0 mL 0.4%(质量分数)的对氨基苯磺酸，静置5 min后，加入1.0 mL 0.2%(质量分数)的盐酸萘乙二胺，加蒸馏水定容，静置15 min后在540 nm处测得吸光度A，空白时的吸光度A0，亚硝酸盐清除率Q(%)，计算公式如下：

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

以没食子酸浓度c为横坐标，以吸光度A为纵坐标，得到回归方程为A= 0.102 3c- 0.029 7,R2=0.999 2。

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对芦柑叶多酚提取率的影响

如图1所示，乙醇浓度在60%时达到顶点，继续增大乙醇浓度，多酚提取率却开始变小。这是因为水的极性比乙醇大，乙醇浓度的增大，乙醇中的含水量降低，导致乙醇极性降低，提高了芦柑叶颗粒中一些具有较小极性的多酚类物质的浸出率。然而当乙醇浓度过高时，溶剂的极性过小，导致芦柑叶颗粒中部分细胞壁上的蛋白质变性，阻碍了多酚类物质的溶出[12]，因此确定最佳乙醇浓度为60%。

图1 乙醇浓度对多酚提取率的影响

图2 超声时间对多酚提取率的影响

2.2.2 超声时间对芦柑叶多酚提取率的影响

如图2所示，超声时间由40 min增加到60 min的过程中，芦柑叶多酚的提取率逐渐增加，并在50 min时达到顶点，继续增加超声时间，多酚提取率却开始变小。这是因为超声时间较短时，芦柑叶多酚还不能充分溶出，但超声时间过长，提取液中部分热敏性较差的多酚类物质会而发生氧化与破坏[13]，因此确定最佳超声时间为50 min。

2.2.3 液料比对芦柑叶多酚提取率的影响

如图3所示，液料比由10 mL/g增加到30 mL/g的过程中，芦柑叶多酚的提取率逐渐增加，并在20 mL/g时达到顶点，继续增加液料比，多酚提取率却开始变小。这是因为液料比的增大有利于芦柑叶颗粒与提取液的充分接触，使溶出的多酚增加。但当液料比过大时，芦柑叶颗粒中的蛋白质等杂质成分会与多酚类物质发生溶出竞争[14]，因此确定最佳液料比为20 mL/g。

图3 液料比对多酚提取率的影响

图4 超声温度对多酚提取率的影响

2.2.4 超声温度对芦柑叶多酚提取率的影响

如图4所示，超声温度由50℃增加到70℃的过程中，芦柑叶多酚的提取率逐渐增加，并在60℃时达到最顶点，继续增加超声温度，多酚提取率却开始变小。这是因为温度的升高，芦柑叶颗粒内物质与溶剂的接触与交换的频率增加，使得酚的提取率增大[15]，但超声温度太高时，多酚中某些热敏性较差的物质会因为温度过高而发生氧化，因此确定最佳超声温度为60℃。

2.3 响应面优化试验

2.3.1 响应面设计及结果

根据单因素实验中各单因素的取值范围，以多酚提取率为响应值(Y)，结合Box-Behnken实验设计原理，确定以乙醇浓度(A)、超声时间(B)、液料比(C)和超声温度(D)4个因素为多酚提取率的影响因素，并设计响应面方案，进行实验，得到实验结果及方差分析分别见表2和表3。

表2 响应面分析方案及结果

利用Design-Expert 8.05b软件对表2中的29个实验结果进行数据处理，得到多酚提取率(Y)与所考察的四个因素的二次多项回归模型：

Y=32.10+0.52A+0.27B+0.10C+1.72D-0.13AB+0.27AC+0.50AD+0.09BC-0.51BD-0.14CD-2.47A2-1.62B2-1.26C2-1.76D2.

表3 方差分析结果

方差分析结果见表3。从表3可知，该回归模型的P<0.000 1，F=10.790，说明响应面优化得到的回归模型达到了非常显著的水平；失拟项P=0.093 7>0.05，失拟项不显著，表明响应面优化得到的回归方程的残差均由随机误差引起。决定系数R2=0.915 2，表明该回归方程具有较好的拟合度，有超过91.52%实验真实值可以利用该回归模型来描述。回归方程模型中一次方项D,二次方项A2、B2、C2、D2对芦柑叶多酚提取率影响均达到了极显著水平(P<0.01);一次方项A对芦柑叶多酚提取率影响达到了显著水平(P<0.05)；剩余的其它项对芦柑叶多酚提取率影响均不显著(P>0.05)。由此说明芦柑叶多酚的各提取因素与芦柑叶多酚提取率之间的函数关系较为复杂。综上分析，该回归模型具有较高的拟合度和较小的误差，准确率高，可以用于芦柑叶多酚提取工艺的分析与预测。

2.3.2 响应曲面图分析

图5为乙醇浓度、超声时间、液料比和超声温度之间的交互作用对芦柑叶多酚提取率影响的响应面和等高线图，通过响应面曲面的斜率和等高线密集度可以直接确定各工艺因素交互作用对芦柑叶多酚提取率的影响程度，响应面曲面的斜率越大，等高线越密集，表明乙醇浓度、超声时间、液料比和超声温度等因素间的交互作用对芦柑叶多酚提取率的影响越大，反之则越小。对图5中的各个响应面和等高线图进行比较分析，可以发现超声时间与超声温度的响应面曲面斜率最大，等高线最密集，说明乙醇浓度、超声时间、液料比和超声温度四个因素间的交互作用对芦柑叶多酚提取率的影响最显著的是超声时间与超声温度，而响应面曲面斜率和等高线最密集程度次之的是乙醇浓度与超声温度，说明工艺因素间的交互作用对芦柑叶多酚提取率的影响程度次之的是乙醇浓度与超声温度，同理可得影响芦柑叶多酚提取率程度的显著性顺序为BD>AD>AC>CD>AB>BC。

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(i)

(j)

(k)

(l)

2.3.3 最优工艺条件验证

根据表2的响应面实验数据，并利用Design-Expert 8.05b软件进行分析，确定超声波辅助提取芦柑叶多酚的最佳工艺参数为：乙醇浓度60.79%、超声时间50.00 min、液料比20.14 mL/g和超声温度62.55℃，此时通过软件计算的芦柑叶多酚提取率的理论值为32.58 mg/g。由于理论的最佳参数，实验条件设置较为不便，将工艺修正为:乙醇浓度61%、超声时间50 min、液料比20 mL/g和超声温度63℃，并在此工艺下进行三次验证实验，得到芦柑叶多酚的提取率为32.27 mg/g，其与模型预测的理论值相对误差为0.95%，说明所建的模型方程准确、可靠，可应用于芦柑叶多酚提取工艺的预测。

2.4 芦柑叶多酚对亚硝酸盐的清除率

如图6所示，随着维生素C和芦柑叶多酚质量浓度的增加，两者对亚硝酸盐的清除率均逐渐增大，说明在所考察的浓度范围内，芦柑叶多酚均能较好地清除亚硝酸盐，且与亚硝酸盐的清除率之间存在一定的量效关系，维生素C和芦柑叶多酚对亚硝酸盐清除的IC50分别为1.41 mg/L和1.93 mg/L。

图6 维生素C和多酚对亚硝酸盐的清除率比较

3 结语

利用天然植物提取物来降解食物中的亚硝酸盐是一种高效且安全的方法，孙昕等[16]采用酶解法对生姜中的姜辣素进行提取，确定了姜辣素的最佳提取工艺，当提取的姜辣素质量浓度为17.5 mg/mL时，亚硝酸盐的清除率可达99%以上，其清除能力与1 mg/mL的的抗坏血酸溶液相当。LUO等[17]研究了两色金鸡菊总皂苷的提取工艺，在总皂苷对亚硝酸盐清除能力和亚硝胺生成的抑制活性的实验过程中发现,两色金鸡菊总皂苷具有一定的亚硝酸盐清除能力，并且具有较好的抑制亚硝胺生成的活性。本文以芦柑叶为原料，考察了乙醇浓度、超声时间、液料比和超声温度四个单因素对芦柑叶多酚提取率的影响，再结合响应面法对提取工艺条件进行优化，确定了芦柑叶多酚的最佳提取工艺：乙醇浓度61%，超声时间50 min，液料比20 mL/g和超声温度63℃，得到芦柑叶多酚的提取率为32.27 mg/g，其与模型预测的理论值相对误差为0.95%，说明所建的模型方程准确、可靠，可应用于芦柑叶多酚提取工艺的预测。在所考察的浓度范围内，芦柑叶多酚均能较好地清除亚硝酸盐，且与亚硝酸盐的清除率之间存在一定的量效关系，芦柑叶多酚对亚硝酸盐清除的IC50为1.93 mg/L，为芦柑叶资源开发成为一种新型的天然亚硝酸盐清除剂提供了科学依据。