虹鳟肌肉中MS-222麻醉剂残留的HPLC-UV检测方法探究

康玉军，康鹏天，陈桂花，何晶晶，刘 哲，施泽强

（1.甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省渔业技术推广总站，甘肃 兰州 730030；3.敦煌市金博特种水产养殖有限公司，甘肃 敦煌 736203）

虹鳟是联合国粮农组织向全球推荐的优良鱼类养殖品种之一。因其骨少肉厚，含肉率高，无肌间刺，肌肉中富含不饱和脂肪酸，深受人们的喜爱[1]。然而，虹鳟对水质要求高、应激性强，在其活鱼运输过程中往往因运输胁迫导致鱼体受伤死亡，影响鲜度[2-3]。

合理使用化学麻醉剂能够降低鱼体新陈代谢，减少对鱼体的伤害，从而提高运输存活率，降低运输成本，达到安全有效运输的目的[2]。MS-222（3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐），是目前广泛应用于水产动物中的麻醉剂，因其具有易处理、效力迅速等优点，已获得美国食品及药物管理局（FDA）批准认证[4]。但由于MS-222的渔用药理学研究滞后，缺乏相关研究资料，所以其在水产业中的应用存在较大的盲目性，误用、滥用现象极为普遍，从而使药物使用效果难以保证；更为甚者，药物残留导致水产食品安全问题[5]。

当前，水产品药物残留和食品安全问题日益引起全世界的广泛关注，往往形成我国水产品出口创汇过程中的绿色贸易壁垒，对国内水产食品安全保障也造成巨大阻力[6]。鉴于MS-222在水产品中的应用越来越广泛，因此，虹鳟养殖生产实践中，必须严格执行MS-222休药期，要科学用药，提高虹鳟商品鱼的产品质量，从而提高经济效益和产品竞争力。这些工作的前提是建立MS-222在动物体内残留检测的标准方法，从而形成完备的药效学、药代动力学资料。

目前，国内外对MS-222在水产动物体内残留检测方法均有研究[5,7-9]，但尚没有虹鳟体内MS-222残留检测方法。因此，尽快建立MS-222的代谢和残留检测方法非常必要。

本文研究了虹鳟肌肉组织中MS-222残留检测的高效液相色谱-紫外（HPLC-UV）检测方法，旨在建立更加简便、快速、灵敏和实用的检测方法，为进一步研究MS-222在虹鳟体内的残留及其代谢规律提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器

福立FL2200高效液相色谱仪，浙江福立分析仪器有限公司。CP214型电子分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；TGL-16M高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司。XH-B型旋涡混合器，江苏康健医疗用品有限公司。YQ-3型组织匀浆机，常州国华电器有限公司。KQ5200E型超声波洗涤仪，昆山市超声仪器有限公司。RE-52C型旋转蒸发仪，金坛医疗仪器厂。SHB-III型台式循环水多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。Eppendorf微量可调移液器，德国EPPENDORF公司。Alumina-B碱性氧化铝固相萃取柱（规格：500 mg/3 ml），上海歇阳生物科技有限公司。

1.2 试剂

对照品：MS-222（含量＞99.5%），Sigma公司。水：水为符合GB/T 6682规定的二级水；甲醇、乙腈、乙酸为色谱纯，正己烷、正丙醇、无水硫酸钠为分析纯，天津市富宇精细化工有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 MS-222标准液配制 准确称取MS-222标准品0.10 g置于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，在旋涡混合器上混匀5 min，制成质量浓度为1.0 mg/ml MS-222标准储备液。

1.3.2 Mcllvaine缓冲液配制 Mcllvaine缓冲液由563 ml的0.1 mol/L柠檬酸溶液和437 ml的0.2 mol/L的磷酸氢二钠溶液混合所制。用分析天平称取21.014 g柠檬酸于烧杯中并加水溶解，定容至1 000 ml制得0.1 mol/L柠檬酸溶液；称取35.814 g磷酸氢二钠于烧杯中并加水溶解，定容至500 ml制得0.2 mol/L的磷酸氢二钠溶液。

1.4 样品采集及处理

1.4.1 样品采集 沿着虹鳟背脊取肌肉，去皮后用组织捣碎匀浆机打成肉糜，冷冻备用。

1.4.2 样品处理 称取2.0 g均质后的虹鳟肌肉组织置于50 ml具塞离心管中，加入20 ml体积比为1∶1的Mcllvaine缓冲液（pH=4.4）与甲醇的混合提取液，涡旋震荡5 min使之充分混合。在30 ℃条件下，超声提取20 min后，以3 000 r/min的速度离心8 min，离心后移取上清液至玻璃试管中（重复2次）。随后向50 ml离心管中再加入20 ml体积比1∶1的Mcllvaine缓冲液（pH=4.4）与甲醇的混合提取液，重复提取1次，合并两次提取的上清液。将两次的上清液在50 ℃水浴下旋转减压蒸发至近干，蒸干后加入10 mlMcllvaine缓冲液（pH=4.4）将残渣溶解，溶解液经化学分析定性滤纸过滤后过C18固相萃取柱进行纯化。萃取柱分别先后以3 ml甲醇和3 ml Mcllvaine缓冲液（pH=4.4）进行激活，将过滤后的残渣溶解液转移到其中，然后用2 ml 7.5%的甲醇溶液淋洗，抽至近干后，用2 ml甲醇和1%乙酸溶液的混合液（体积比为1∶1）进行洗脱。洗脱液收集5 ml于离心管中，过0.45 μm微孔滤膜后用甲醇与1%乙酸的混合溶液定容到2 ml容量瓶中，待测。

1.5 色谱条件

安捷伦C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；进样量：50 μl；流动相：甲醇∶水∶乙酸=6 5 ∶3 5 ∶1（等梯度洗脱）；流动相速度：0.6 ml/min；柱温：35 ℃；检测波长：223 nm（紫外线检测）。

1.6 绘制标准曲线

用甲醇将MS-222标准储备液稀释，分别在空白肌肉样品中按25 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg、400 μg/kg、800 μg/kg进行添加，按照1.4、1.5步骤测定，记录峰面积，以MS-222色谱图峰面积为纵坐标、MS-222浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.7 方法学考察

1.7.1 灵敏度 将逐步稀释的MS-222对照品加入空白样品后上机测定，以信噪比（S/N）=3时的样品浓度为最低检测限。

1.7.2 精密度 标准储备液重复上机测定6次，计算相对标准偏差RSD。

1.7.3 回收率和变异系数 取空白虹鳟肌肉样品6份，分别准确加入不同浓度的MS-222，之后按上文样品处理方法和色谱条件进行测定，计算加标回收率和变异系数。

2 结果与分析

2.1 色谱图

按1.5步骤对MS-222标准品和加标后的空白虹鳟肌肉样品进行分析，结果见图1。由图1可知，MS-222的HPLC出峰时间为6.1 min左右，目标峰分离良好、峰形尖锐、对称，灵敏度高。

2.2 线性范围和灵敏度

在每个空白肌肉样品中分别添加25 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg、400 μg/kg、800 μg/kg的MS-222，每个浓度设置3个重复。本研究中MS-222的线性范围为25～800 μg/kg。在此线性范围内，y=3.12×104x，相关系数为0.999 8，线性关系良好，定量的准确性高。将MS-222对照品准确加入空白样品后上机测定，依据信噪比（S/N）测得检测限为20 μg/kg。

2.3 精密度

虹鳟肌肉组织中添加不同浓度MS-222的HPLC-UV检测方法精密度见表1。由表1可知，本研究的方法精密度在2.63%～4.74%之间，说明样品前处理方法得当，样品质量较为稳定。

2.4 回收率与变异系数

虹鳟肌肉组织中添加不同浓度MS-222的回收率和变异系数见表2。结果显示：所有加标浓度组的MS-222回收率均＞88%，批内变异系数＜1.2%，批间变异系数均＜5%。结果表明该方法的重复性和重现性好。

3 讨论

图1 MS-222标准品（A）和空白虹鳟肌肉加标（B）的HPLC-UV色谱图

表1 虹鳟肌肉组织中添加MS-222检测方法的精密度

表2 虹鳟肌肉组织中添加MS-222的检测回收率和变异系数

MS-222为白色晶状粉末，其水溶性好，是美国FDA批准的唯一可用于水产品的渔用麻醉剂。MS-222具有良好的镇静安定作用，在活鱼麻醉运输中可提高鱼体的存活率以及上市鲜度[10]。随着人们物质生活水平的不断提高，其对动物源性食品的品质和食品安全问题也越来越关注。然而，对于处在商品流通环节的渔用麻醉剂的规范使用和药物残留问题，目前关注度尚有不足。MS-222的使用剂量往往取决于水产动物的种类、年龄、规格以及水体温度等诸多因素，一般介于25～100 mg/L[11-12]。而生产实践中，销售商往往仅凭借经验掌握MS-222的用量。此外，有研究显示MS-222主要蓄积于鱼体的肝脏和脾脏等部位，在肌肉中的残留量较低，但美国FDA依旧规定MS-222应用于养殖鱼类，需有21 d的休药期[12]。目前我国尚未建立有关MS-222的规范使用和残留限量标准，很多商家出于短期利益考量，并未对相关的商品鱼进行休药暂养，可能存在麻醉剂残留的食品安全风险[5]。因此，尽快建立基于MS-222的代谢和残留检测方法的渔用麻醉剂使用和限量标准迫在眉睫。

MS-222是一种极性化合物，依据相似相溶原理，一般多选用极性较强的提取液，如极性有机溶剂、缓冲溶液/水与有机溶剂的混合溶液等。常见的MS-222提取液有水、甲醇∶水（1∶1）、乙腈∶水（1∶1）、乙酸-乙酸钠缓冲液等[13]。本研究参考已有文献报道，选用Mcllvaine缓冲液（pH=4.4）与甲醇的混合提取液。为了提高MS-222的回收率，采用匀浆和超声波处理相结合的方法，且虹鳟肌肉组织匀浆后超声提取两次。

虹鳟作为典型的冷水性鱼类，肌肉成分复杂，富含油脂[14]。这对于用于HPLC分析的肌肉组织样品制备造成了一定程度的不利影响，如果样品处理不当，易产生过多杂质峰，掩蔽目标峰。因此，样品前处理中的纯化步骤尤为重要。在预试验阶段，本研究对比了C18、C8、苯基、氰基等固相萃取柱的样品纯化效果，最终采用C18萃取柱用进行样品纯化。

本研究中的HPLC分析采用的是C18柱分离，馏分使用223 nm波长的紫外线进行检测，最终计算得到检测限为20 μg/kg。结合文献报道[5,15]，紫外检测器对于低浓度样品，存在基质对定性、定量结果影响大的问题，方法的灵敏度尚有提升空间。关于色谱分析过程中的柱温，预实验阶段分别在35 ℃和50 ℃下对MS-222对照品溶液进行HPLC-UV检测，结果显示35 ℃时目标峰的峰型较50 ℃时尖锐，考察保留时间、目标峰与杂质峰的分离程度等方面，两个温度点无显著差异。考虑节能、色谱柱寿命等因素，本研究中选35 ℃作为液相色谱仪的检测温度。参考Scherpenisse[7]、朱敏[10]和黎智广[15]等的研究，本研究中先后采用甲醇∶水∶乙酸=65∶35∶1（流动相1）、0.5%甲酸∶乙腈=60∶40（流动相2）、甲醇∶1%乙酸=75∶25（流动相3）和三种流动相对50.0 μg/ml的MS-222标准品溶液进行了等梯度洗脱。实验结果显示，使用流动相1洗脱所得峰形相对较好，基线平且低，目标峰出峰时间在6.1～6.9 min之间，且在此时间内基本无杂质峰。与已有相关报道的研究结果相比[16-17]，该流动相在一定程度上缩短了目标峰的保留时间，且检测加标样品时目标峰分离更好。因而，将甲醇∶水∶乙酸=65∶35∶1的洗脱方式作为最终流动相洗脱梯度。

4 结论

MS-222在虹鳟肌肉中的HPLC-UV残留检测方法具有操作便捷、提取率高、重复性和重现性好等优点，具备良好的检测特异性和精密度，加标回收率＞88%，批内变异系数＜1.2%，批间变异系数均＜5%，方法的重复性和重现性好，满足一般MS-222残留分析的需要，可为进一步研究MS-222在虹鳟体内的残留及其代谢规律提供技术支持。