虹鳟和硬头鳟早期幼鱼渗透生理及能量平衡的比较研究❋

2019-02-21熊莹槐杨静雯董双林周演根

中国海洋大学学报（自然科学版） 2019年3期

熊莹槐，杨静雯，董双林,2❋❋，王芳,2，王鑫，周演根

(1．海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学)，山东青岛 266003； 2．青岛海洋科学与技术国家实验室,海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东青岛 266235)

在过去30年中，人们十分关注鲑科鱼类对盐度的适应性，因为这与鲑科(Salmonidae)鱼类的发育、品质、移入海水网箱的时间密切相关[1-5]。研究发现，陆封型的种类如溪红点鲑(Salvelinusfontinalis)、湖红点鲑(Salvelinusnamaycush)和虹鳟(Oncorhynchusmykiss)等，无需降海即可正常发育[6-9]，而溯河型的种类如大西洋鲑(Salmosalar)、硬头鳟(Oncorhynchusmykiss)、银大麻哈鱼(Oncorhynchuskisutch)等则需要在淡水中生活一年左右，当达到临界最小规格后方可入海[10-12]。虹鳟是世界上广泛养殖的鲑科鱼类之一，属陆封类型, 而硬头鳟是虹鳟的降海洄游型[8]。有报道称，虹鳟和硬头鳟幼鱼在海水中比在淡水中长得更快、食物转化率更高[9, 13]。

由于我国海域夏季水温较高，目前还鲜有在开放海域成功地规模化养殖虹鳟或硬头鳟的报道。黄海中部洼地夏季存在一个巨大的冷水团，夏季底层水温在4.6～9.3 ℃，且水质良好，具有采用相关技术开展规模化养殖鲑科鱼类的天然条件[14-15]。虹鳟和硬头鳟适于利用黄海冷水团进行陆海接力养殖，即先在淡水中繁殖，培育成鱼种，然后在适宜温度的海水中养成商品鱼。从淡水移入海水养殖就涉及到一个盐度过渡问题，因此，查明特定规格鱼类较适生长的盐度就十分重要。

广盐性鱼类具有较强的渗透压调控能力来适应盐度的变化，在高渗环境中广盐性鱼类主要通过吞饮海水来补充体表丢失的水分，鳃上皮细胞基底膜上的Na+-K+-ATP酶(NKA)和Ca2+-Mg2+-ATP酶(CMA)活性来调节Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Cl-的平衡以适应外界盐度的变化[16-21]。NKA和CMA不仅能转运特定的离子，还能为整个离子转运机制提供动力，因此其活力的变化可能引起渗透压调节能量消耗的改变，并最终导致鱼类能量代谢和分配的变化[22-24]。大量研究表明，一些低代谢率的种类，如虹鳟、鲶(Silurusasotus)、鳉(Oryziaslatipes)用于渗透压调节的能量占代谢产出的20%～50%[25-30]，而金枪鱼(Thunnusthynnus)用于渗透调节的能量占代谢产出的比例高达54%～68%[31]。能量是细胞中各项理化活动正常进行的基础[32]，其在鱼体内储备的变化和平衡，能够诠释鱼类对不同环境条件的响应。因此，当鱼体渗透压调节所需要的能量较少时，更多的能量就可用于改善生长[17]。

淡水起源的虹鳟和硬头鳟需要在淡水中孵化，但在孵化后不久其是否就具有了适应一定盐度的能力呢？为了了解虹鳟和硬头鳟早期幼鱼耐盐能力及其差异，本文比较了盐度对起始体重为3.6 g左右虹鳟和硬头鳟的血清渗透压、离子浓度、鳃NKA、CMA及腺苷酸的影响，探讨了其耐盐的渗透压生理学及能量平衡机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用虹鳟和硬头鳟均采自日照市万泽丰鲑鳟鱼繁育基地，孵化自丹麦进口的三倍体受精卵。实验虹鳟和硬头鳟初始质量分别为(3.55±0.03)和(3.57±0.07)g，体长分别为(6.87±0.38)和(6.87±0.35)cm。将实验鱼在淡水中暂养2周(除盐度外，其他暂养条件均与实验条件相同)。每天在8:00和16:00各投喂人工配合饲料1次(能量(19.02±0.17)kJ·g-1, 蛋白质(48.86±1.64)%,脂肪(13.15±3.99)%, 灰分(8.29±0.13)%, 水分(4.34±0.16)%)。

1.2 实验方法

暂养结束后，分别随机挑选相同规格活泼健壮的实验鱼开展实验。设置了0、5、10、15、20、25和30共7个盐度处理组，分别以S0、S5、S10、S15、S20、S25和S30表示。每个盐度处理分别设置3个重复，每个重复放养8尾鱼。

养鱼容器为方形玻璃水族箱(长L=0.55 m，宽W=0.29 m,高H=0.36 m)，实际用水量为50 L。不同盐度的实验用水由经过沉淀的自然海水(盐度为30)和淡水(盐度为0)调配而成。以每天升高盐度1～2的速率，分别驯化至 5、10、15、20、25和 30，至目标盐度后，稳定1周后进行相关实验。

实验期间，每天在8:00和16:00各投喂人工配合饲料1次。每天换水1次，每次换水100%。实验期间温度为(16.0±0.5)℃，光照周期L∶D=12∶12。为保证水体中充足的溶氧，每个水族箱用气泵24 h充气。实验持续40天。

1.3 样品的采集、处理及测定

实验结束时，停食24 h，使用麻醉剂MS-222对鱼进行麻醉。麻醉后先尾静脉采血，然后解剖进行鳃和肌肉组织的取样。血液在4 ℃冰箱放置3 h，自然分层后4 000 r/min离心10 min，之后抽取上层血清，用于血清渗透压及Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-离子浓度测定。鳃和肌肉组织经液氮迅速冷冻后于-80 ℃超低温冰箱保存，用于鳃丝NKA、CMA酶活力及鳃、肌肉组织腺苷酸的测定。

血清渗透压采用露点渗透压仪(Vapro-5520，美国)进行测定，用质量渗透浓度来表示，定义为1 kg溶剂中1 mmol溶质为一个渗透压单位(mOsm/kg)。血清离子采用罗氏全自动生化分析仪(MODULAR P-800，瑞士)测定。

鳃NKA和CMA酶活力采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行检测，用定磷法测定酶活性，具体的测定方法参照说明书进行。定义每小时每毫克蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷的量为一个酶活力单位，单位为μ mol Pi(mg prot·h)。

腺苷酸含量采用Agilent 1100高效液相色谱仪(HPLC, Agilent Corp., USA)进行测定。适量冷冻肌肉和鳃组织样品于液氮环境中磨碎呈粉状后，取一定量粉样，加入9倍体积的冰冷高氯酸(0.9 mol·L-1)溶液进行匀浆。匀浆液于7 000g、4 ℃下离心5 min，收集上清液并以3.75 mol·L-1K2CO3中和至pH=6.5～7.0。中和后的溶液于7 000g、4 ℃下离心10 min，收集上清液用于测定相应组织中腺苷酸含量。组织样品经0.45 μm微孔滤膜过滤后用于测定腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)和腺苷一磷酸(AMP)含量。以UltimateTMAQ-C18柱(4.6 mm×250 mm)，柱温35 ℃，洗脱时间24 min，流速1.0 mL·min-1，检测波长为254 nm。以磷酸缓冲液(40 mmoL·L-1KH2PO4和60 mmol·L-1K2HPO4，pH=6.50)作为流动相。根据测得的峰面积和标准曲线计算腺苷酸含量(微摩尔每克组织，μmol·gww-1)。标准曲线由已知浓度的ATP(0～0.8 mmol·L-1)、ADP(0～1.2 mmol·L-1)和AMP(0～1.5 mmol·L-1)溶液制作而成。回归曲线方程、总腺苷酸(TAN)含量计算公式如下所示。

ATP：Y= 15.704X+ 10.473，R2= 1.000；

ADP：Y= 18.25X-27.503，R2= 0.999 9；

AMP：Y= 18.502X-31.28，R2= 0.999 9；

TAN = [ATP] + [ADP] + [AMP]。

式中：Y表示腺苷酸峰面积，X表示腺苷酸浓度，[ATP]、[ADP]和[AMP]分别表示ATP、ADP和AMP浓度。

1.4 数据统计

数据的统计分析皆以SPSS21.0软件进行。所得数据用双因素方差(ANOVA)及Tukey多重比较进行分析处理，以P<0.05作为差异显著水平。所得数据以平均数±标准差(Mean ±SD)表示，作图软件为SigmaPlot 12.5。

2 结果

2.1 不同盐度下虹鳟和硬头鳟的血清鳟渗透压

血清渗透压受盐度和鱼种类的显著影响，但它们的交互作用对血清渗透压影响不显著(见图1、表1)。随盐度升高虹鳟和硬头鳟血清渗透压均升高，在S30组达到最大值，且显著高于其余各组(P<0.05)。各组虹鳟血清渗透压均显著高于硬头鳟(P<0.05)。

2.2 不同盐度下虹鳟和硬头鳟的血清离子含量

血清Na+、K+、Ca2+和Mg2+受盐度、鱼种类及其交互作用的显著影响(见图2、表1)。随盐度升高虹鳟和硬头鳟血清中Na+、K+、Ca2+和Mg2+均升高，在S30组达到最大值，且显著高于其余各组(P<0.05)。除S0和S5组外，各组虹鳟血清Na+均显著高于硬头鳟(P<0.05)(见图2a)。在S15、S20、S25和S30组，虹鳟血清K+均显著高于硬头鳟(P<0.05)(见图2b)。除S0和S5组外，虹鳟血清Ca2+均显著高于硬头鳟(P<0.05)(见图2c)。除S0组外，虹鳟血清Mg2+均显著高于硬头鳟(P<0.05)(见图2d)。

(“*”表示同一盐度下虹鳟和硬头鳟之间差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示不同盐度间差异显著(P<0.05)，下同。Stars (*) denote a significant difference between rainbow and steelhead trout under corresponding salinity (P<0.05). Groups of bars with different lower case letters are significantly different (P<0.05), the same below.)

图1 不同盐度下虹鳟和硬头鳟的血清鳟渗透压Fig. 1 Serum osmolality of the rainbow and steelhead trout in different salinity treatments

注：NKA表示Na+-K+-ATP酶，CMA表示Ca2+-Mg2+-ATP酶。

Note: NKA denotes the Na+-K+-ATPse，CMA denotes the Ca2+-Mg2+-ATPse.

血清Cl-受盐度和鱼种类的显著影响，但它们的交互作用对血清渗透压影响不显著(见图3、表1)。虹鳟和硬头鳟血清中Cl-均随盐度升高而升高，在S30组达到最大值，且显著高于其余各组(P<0.05)。各组虹鳟血清Cl-均显著高于硬头鳟(P<0.05)。

2.3 不同盐度下虹鳟、硬头鳟鳃组织的Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性

鳃组织的NKA和CMA酶活性受盐度、鱼种类及其交互作用的显著影响(见图4、表1)。虹鳟和硬头鳟分别在S5和S10组鳃组织的NKA和CMA酶活性最低(见图4)，均显著低于其余各组(P<0.05)，而S30组显著高于其它各组(P<0.05)。除S5组，各组虹鳟NKA酶均显著高于硬头鳟(P<0.05)(见图4a)。除S0组，其余各组虹鳟CMA酶活性均显著高于硬头鳟(P<0.05)(见图4b)。

(“”表示同一盐度下虹鳟和硬头鳟之间差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示虹鳟不同盐度间差异显著(P<0.05)，大写字母表示硬头鳟不同盐度间差异显著(P<0.05)，下同。Stars () denote a significant difference between rainbow and steelhead trout under corresponding salinity (P<0.05). Different lower case letters represent significant difference among rainbow trout treatments, while different capital letters denote the significant difference among steelhead trout treatments (P< 0.05), the same below.)

图2 不同盐度下虹鳟和硬头鳟的血清Na+、K+、Ca2+和Mg2+含量
Fig.2 Serum Na+, K+, Ca2+and Mg2+contents of rainbow and steelhead trout in different salinity treatments

图3 不同盐度下虹鳟和硬头鳟的血清Cl-含量Fig. 3 Serum Cl-contents of rainbow and steelhead trout in different salinity treatments

2.4 不同盐度下虹鳟、硬头鳟肌肉和鳃的腺苷酸含量

图5为虹鳟和硬头鳟肌肉中的腺苷酸含量。由图5可知，鱼种类、盐度及其交互作用均对TAN无显著影响(见图5a，表2)。ATP、AMP/ATP和ADP/ATP受盐度、鱼种类及其交互作用的显著影响(见图5b、c、d，表2)。虹鳟和硬头鳟ATP分别在S5和S10组最高(见图5b)，且显著高于其余各组(P<0.05)。在S0、S10、S15、S20和S25组，硬头鳟ATP显著高于虹鳟(P<0.05)，而在S5组，虹鳟ATP显著高于硬头鳟(P<0.05)。

虹鳟和硬头鳟分别在S5和S10组AMP/ATP和ADP/ATP最低(见图5c、d)，且显著低于其余各组(P<0.05)。在S10、S15、S20、S25和S30组，硬头鳟AMP/ATP显著低于虹鳟(P<0.05)，而在S5组，虹鳟AMP/ATP显著低于硬头鳟(P<0.05)。除S5组，其余各组硬头鳟ADP/ATP均显著低于虹鳟(P<0.05)。

图4 不同盐度下虹鳟、硬头鳟鳃组织的Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性Fig.4 Effects of salinity on the activity of Na+-K+-ATP and Ca2+-Mg2+-ATP in gill of rainbow and steelhead trout

(ATP为腺苷三磷酸，ADP为腺苷二磷酸，AMP为腺苷一磷酸，TAN为三者之和，下同。ATP is adenosine triphosphate, ADP is adenosine diphosphate, AMP is adenosine monophosphate, TAN is the sum of the ATP, ADP and AMP, the same below.)

图5 不同盐度下虹鳟和硬头鳟肌肉的腺苷酸含量Fig. 5 Effects of salinity on adenine nucleotides in the muscles of rainbow and steelhead trout

图6为虹鳟和硬头鳟在鳃中的腺苷酸含量。由图6可知，鱼种类、盐度及其交互作用均对TAN无显著影响(见图6a、表2)。ATP、AMP/ATP和ADP/ATP受盐度、鱼种类及其交互作用的显著影响(见图6b、c、d、表2)。虹鳟和硬头鳟的ATP分别在S5和S10组最高(见图6b)，且显著高于其余各组(P<0.05)。在S5组，硬头鳟ATP显著低于虹鳟(P<0.05)，其余各组均显著高于虹鳟(P<0.05)。

虹鳟和硬头鳟分别在S5和S10组AMP/ATP和ADP/ATP最低(见图6c、d)，且显著低于其余各组(P<0.05)。在S5组，硬头鳟AMP/ATP和ADP/ATP显著高于虹鳟(P<0.05)，其余各组均显著低于虹鳟(P<0.05)。

图6 不同盐度下虹鳟和硬头鳟鳃的腺苷酸含量Fig. 6 Effects of salinity on adenine nucleotides in the gills of rainbow and steelhead trout

3 讨论

参与鱼类调控血清渗透压平衡的离子主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Cl-等[33, 34]。在外界盐度变化时，硬骨鱼类血清渗透压起初会随之迅速升高或降低，随后将恢复回初始状态，整个生理过程受渗透压调节机制的影响[35]。本研究中，虹鳟和硬头鳟血清渗透压及Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Cl-均随盐度升高而升高，S25和S30组均显著高于其余各组。在实验进行了7天后，S20、S25和S30组的虹鳟各死亡0、1和3尾，而硬头鳟各死亡0、0和2尾；本实验结束时，虹鳟在S20、S25和S30组存活率分别为95.83%±7.22%、58.33%±7.23%和37.50%±21.65%，其余各组存活率为100%；硬头鳟在S20、S25和S30组存活率分别为91.67%±7.22%、87.50%±7.23%和37.50%±21.65%(数据待发表)，可推测虹鳟和硬头鳟早期幼鱼耐盐上限分别为20和25，高盐胁迫能造成虹鳟和硬头鳟血清中离子的浓缩，以致渗透压长时间处于较高水平。相关研究表明，莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambicus)[36]、点篮子鱼(Siganusguttatas)[37]、大西洋鲟(Acipenseridae)[38]、褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[39]等广盐性鱼类的血清渗透压和离子浓度与盐度成正比。另外，在S15、S20、S25和S30组，硬头鳟血清渗透压和离子浓度均显著低于虹鳟，表明硬头鳟对离子的外排速度快于虹鳟，因此也更耐盐。有研究表明，不同鱼类渗透压和离子浓度变化的程度，受种间差异、盐度变化范围等的影响[40-41]，一般来说溯河型鲑科鱼类渗透调节能力强于陆封型种类[42]。

鳃上皮细胞基底膜上的NKA和CMA是鱼类调节渗透平衡的重要酶，其酶活力与血清渗透压水平的变化紧密相关[16-19]。在本研究中，虹鳟、硬头鳟鳃组织NKA和CMA酶活性分别在S5和S10组显著低于其余各组，而均在S30组显著高于其余各组；在S10、S15、S20、S25和S30组，虹鳟鳃丝NKA和CMA酶活性均显著高于硬头鳟。这可能由于在高盐度组虹鳟和硬头鳟体内外渗透压差值较大，血清渗透压较高，需要通过活性较高的NKA和CMA酶加快外排离子的速度，以维持稳定的渗透压。相关研究表明，当广盐性鱼类处于等渗环境下，NKA酶活性呈最低值[43]，此时生长较海水中也更有优势[44-46]。

在盐度胁迫时，虹鳟和硬头鳟会通过机体的渗透压调控机制，对离子和水分的吸收和分泌，以实现内环境的稳定，这一系列生理活动需要耗费大量的能量[31, 47-48]。本研究发现，虹鳟、硬头鳟肌肉组织ATP含量分别在S5和S10组显著高于其余各组，这说明虹鳟、硬头鳟分别在盐度5和10能量储备高，有较多的能量可用于生长。此外，虹鳟、硬头鳟鳃中的ATP含量均在S30组显著低于其余各组，而AMP/ATP显著高于其余各组，表明在S30组虹鳟、硬头鳟需要更多的能量用于渗透调节。这可能是由于盐度5和10分别接近虹鳟、硬头鳟的等渗点。在等渗环境下广盐性鱼类用于渗透调节的能量消耗最少，此时用于生长的能量比例较低渗和高渗条件下更高，因而更有利于生长[17, 49]。另外，能量的消耗与鱼的种类、盐度、驯化时间和生活习性等密切相关[50]。本研究结果显示，在S10、S15、S20、S25和S30组，硬头鳟肌肉和鳃组织AMP/ATP和ADP/ATP均显著低于虹鳟，这表明，较比虹鳟而言总体上硬头鳟渗透压调节等耗能较少，用于生长的能量分配比例会较高。在不同环境条件下，鱼体内会形成一系列适应性生理响应，而这些活动均依赖机体产生的能量，因此能量平衡对鱼类在不同盐度条件下的耐受性以及生长水平具有重要影响[51-53]。