毒蕈碱受体通过Yes相关蛋白信号对口腔鳞状细胞癌生物学行为的实验研究

江涵 神应强 陈谦明

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 口腔黏膜病国家临床重点专科中国医学科学院口腔黏膜癌变与防治创新单元 四川大学华西口腔医院口腔黏膜病科 成都 610041

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是最常见的头颈部恶性肿瘤，具有难治疗、易转移、预后差、易复发等特点，5年生存率低于50%。早诊断和早治疗是提高OSCC患者生存率的关键[1-2]。早期就有研究揭示毒蕈碱（muscarinic，m）受体具有作为致癌基因的潜能[3-4]。近年来，围绕m受体所展开的基础研究也逐渐增多,但在不同类型的癌症中，其作用机制尚无定论。因此，本研究利用癌症基因图谱（the cancer gene atlas，TCGA）数据库及若干OSCC细胞系探讨了m受体在OSCC 中的表达情况，并研究了m受体激动剂卡巴胆碱在OSCC发生发展中的潜在作用及可能机制，以期为OSCC 的治疗提供新靶标。

1 材料和方法

1.1 细胞株及主要试剂

人OSCC细胞系Cal27、HSC3、HSC4、HN4、HN12以及人口腔上皮角质细胞HOK（四川大学口腔疾病研究国家重点实验室）。逆转录试剂盒（Takara公司，日本）。实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR） 核酸扩增检测系统试剂盒（Applied Biosystems公司，美国）。卡巴胆碱试剂（Sigma-Aldrich公司，美国）。细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒CCK8（Dojindo公司，日本）。Matrigel（BD公司，美国），Transwell小室（Corning公司，美国）。Yes相关蛋白（Yes related protein，YAP）-1抗体（Abcam公司，美国），p-YAP（S127）抗体（Cell signaling technology公司，美国）。

1.2 引物合成

根据既往文献[5]确定目的基因及内参基因序列及引物。引物序列如表1。

表1 m受体基因的引物序列Tab 1 Primer sequence of m receptor genes

1.3 TCGA数据库查询

通过TCGA数据库查询m受体亚型基因在人体各种癌症类型中及在头颈部肿痛和正常组织中的差异表达水平，再进一步查询生存曲线分析各受体亚型基因对预后的影响。

1.4 RT-qPCR

分别提取人OSCC细胞系Cal27、HSC3、HSC4、HN4、HN12以及人口腔上皮胶质细胞HOK的总RNA，通过逆转录试剂盒逆转录分别获得各基因组DNA，用RT-qPCR扩增chrm1、chrm3、chrm5，反应体系为20 μL，SYBRTMSelect Master Mix预混液10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，无酶水7.2 μL。预变性95 ℃，2 min；变性95 ℃，15 s；退火65 ℃，15 s，延伸72 ℃，1 min共40个循环。每个样品3个复孔，采用2-ΔΔCT法进行结果分析。

1.5 CCK8细胞增殖实验

将卡巴胆碱用灭菌水配制成100 mmol·L-1母液溶解后置于-80 ℃保存，实验时处理组按不同浓度对母液稀释，对照组加入等体积的稀释液。取处于对数生长期的细胞系HSC4和HN12，分别消化离心后，再分别均匀铺于96孔板中，待细胞贴壁生长至约50%后，加入浓度梯度的卡巴胆碱（10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1 μmol·L-1）工作液，对照组换成等体积的细胞培养液，继续培养24 h后向每孔加入含有10%CCK8的200 μL工作液，孵育1.5 h后用酶标仪测定在450 nm处的光密度（optical density，OD）值，计算细胞存活率。

1.6 Transwell细胞侵袭实验

提前将Matrigel于4 ℃融化，按照1∶4的比例用无血清培养基稀释Matrigel，再将其均匀铺于Transwell小室内膜上，置于37 ℃孵箱中1 h 使Matrigel凝固。将生长良好的OSCC细胞系HSC4和HN12消化离心，用无血清的培养基将悬液调整为每毫升5×105个备用。取出24孔板，先将含有浓度为1 μmol·L-1的卡巴胆碱无血清培养基500 μL加入24孔板，再将小室置于孔板中，向每个小室内各加入上述处理好的细胞悬液200 μL，常规培养24 h后，4%多聚甲醛固定，磷酸缓冲盐溶液洗涤，结晶紫染色后漂洗除去多余染料，将小室的膜裁剪下来封片后置于显微镜下观察。采集随机选取的4个区域的固定细胞图像，统计侵袭细胞数。

1.7 细胞免疫荧光实验

通过细胞免疫荧光实验检测卡巴胆碱对OSCC细胞核转位的影响。将生长良好的OSCC细胞系HN12的细胞悬液稀释成每毫升1×104个加入4孔腔室载玻片中，每孔0.5 mL。待细胞贴壁后，换成含有卡巴胆碱（工作浓度为1 μmol·L-1）的培养基处理24 h后，将培养基弃去，经固定、透膜及封闭后加入YAP1一抗稀释液4 ℃孵育过夜，磷酸盐吐温缓冲液洗涤3次，每次10 min，加入荧光二抗室温孵育1 h，磷酸盐吐温缓冲液洗涤3次，每次15 min，滴加少许4’，6-二脒基-2-苯基吲哚盖上盖玻片于荧光显微镜下观察。

1.8 Western Blot实验

通过Western Blot实验检测经卡巴胆碱处理后Hippo信号通路相关蛋白的表达水平。收集经卡巴胆碱（工作浓度为1 μmol·L-1）处理2 h的OSCC细胞HN12的蛋白，使用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度后并加入5×上样缓冲液混合煮沸10 min行凝胶电泳，结束后用湿转法将蛋白质转移至聚偏氟乙烯聚偏氟乙烯膜，用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭2 h后，根据相应蛋白相对分子质量大小裁剪聚偏氟乙烯膜，分别加入对应的YAP1，p-YAP（S127）一抗稀释液4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗涤3次，每次15 min，加入5 000×稀释的山羊抗兔IgG室温孵育1 h，TBST缓冲液洗涤3次，每次15 min，用Western Blot显影液显影。

1.9 统计学分析

用Graphpad Prism 8.0软件进行分析，多组之间的比较用单因素方差分析，两两比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA数据库查询结果分析

为整体了解m 受体基因（chrm1、chrm3、chrm5）在HNSC中的表达及与正常组织的表达差异性和对预后的影响，通过TCGA数据库检索，结果显示如图1A～C所示：在人体多种类型的癌症中，与相应正常组织相比，m受体基因均有表达差异。其中chrm1在HNSC中的表达降低，而chrm3、chrm5在HNSC中的表达升高。生存分析曲线结果显示（图1D～F）：chrm1和chrm5对生存期无影响，但是chrm3表达高的组别比正常组生存期低，且差异有统计学意义，提示chrm3与预后相关。

图1 m受体亚型基因的差异表达及生存分析Fig 1 The expression of m receptor subtype genes and survival analysis in TCGA database

2.2 RT-qPCR结果分析

通过RT-qPCR 反应扩增的目的基因chrm1、chrm3、chrm5片段，结果显示：相对于人口腔上皮角质细胞HOK，人OSCC 细胞Cal27、HSC3、HSC4、HN4、HN12中，HN4和HN12细胞chrm3高表达，且差异有统计学意义（P＜0.000 1）（图2B）。此外，chrm1和chrm5在肿瘤细胞中及正常 细胞中无明显差异（图2A、C）。

图2 OSCC细胞株中m受体基因的表达水平Fig 2 The expression of m receptor subtype genes in OSCC cells

2.3 CCK8 细胞增殖与Transwell 细胞侵袭实验结果分析

通过CCK8细胞增殖实验在卡巴胆碱作用细胞24 h后结果（图3A）显示：随着卡巴胆碱浓度的增高，chrm3高表达的HN12细胞增殖活性逐渐增强，且差异有统计学意义（P＜0.01），而chrm3受体正常表达的HSC4细胞系的增殖则不受卡巴胆碱浓度的影响。为了进一步检测卡巴胆碱有无诱导OSCC细胞侵袭的作用，仍然选取HSC4和HN12细胞，在卡巴胆碱工作浓度为1 μmol·L-1进行Transwell细胞侵袭实验，结果如图3B～G所示：卡巴胆碱对m受体基因不同表达水平的细胞均有促进侵袭的作用，且差异有统计学意义（P＜0.01）。

图3 卡巴胆碱在不同浓度下分别对HN12和HSC4细胞增殖活性及侵袭能力的影响Fig 3 Carbachol on the proliferation and invasion ability of HN12 and HSC-4 cells at different concentrations

2.4 细胞免疫荧光实验

为了分析卡巴胆碱是否通过影响Hippo信号通路来促进OSCC细胞的增殖和侵袭，采用细胞免疫荧光实验对比加入卡巴胆碱后YAP的细胞核转位有无变化。结果如图4所示：与对照组相比，卡巴胆碱处理后，HN12细胞中YAP的核转位增加，且差异有统计学意义（P＜0.01）。

图4 卡巴胆碱对OSCC细胞内YAP核转位的影响Fig 4 The effect of Carbachol on the nuclear translocation of YAP in OSCC cells

2.5 Western Blot实验

为了进一步分析上述结果中YAP和p-YAP在细胞内表达水平的变化情况，采用Western Blot实验对比在经过卡巴胆碱处理后的OSCC细胞中YAP的p-YAP的表达水平。结果如图5所示：与对照组相比，卡巴胆碱处理后，HN12细胞中的YAP和p-YAP具有差异表达，其中HN12细胞中YAP表达升高，而p-YAP（S127）表达降低，且差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图5 YAP和p-YAP经过卡巴胆碱处理后在OSCC细胞中的表达水平Fig 5 The expression level of YAP and p-YAP in OSCC cells after treatment with Carbachol

3 讨论

OSCC的治疗虽在近几年有所进步，但是由于其预后差，寻找新的有效的治疗靶点及药物仍是亟待解决的问题。神经对组织生长的依赖性最初是在19世纪的蝾螈肢体再生中被发现的。直至近年以来，研究者才逐渐关注周围神经对肿瘤的调控作用，并有一系列的研究在不同的恶性肿瘤中均有重要发现。其中，m受体作为周围神经所分泌的神经递质的重要受体之一，其致癌潜能在前列腺癌中就有分析报道[4]。随着研究的深入，m1受体被证实可诱导前列腺癌细胞的扩散[5]，并且通过使用这些受体的激动剂也有了更进一步的研究结果。有学者选择m受体卡巴胆碱来进行研究。卡巴胆碱又名氯化氨甲酸胆碱，为乙酰胆碱的类似物，是一种非选择性胆碱能受体激动剂，它可以通过与m受体相互作用而发挥相应的生理生化作用。研究结果发现，使用卡巴胆碱激活m受体后可通过FAK-YAP信号轴驱动去势抵抗性前列腺癌的肿瘤细胞的生长[6]。然而，在不同的肿瘤类型中，m受体及其亚型的作用却不尽相同。研究[7-8]显示，在胰腺导管腺癌和乳腺癌中，m1受体发挥了抑制肿瘤生长的作用。

本研究首先通过查询TCGA数据库和RT-qPCR实验确定了与正常细胞相比，人OSCC细胞系中有毒蕈碱受体，特别是m3受体高表达。利用非选择性m受体激动剂卡巴胆碱进行CCK8细胞增殖及Transwell细胞侵袭实验分析，发现随着卡巴胆碱浓度的增高，促进增殖及侵袭的作用越强。为进一步探究其作用机制，发现YAP与肿瘤的发生发展密切相关，YAP蛋白作为Hippo信号通路中关键因子在调控癌细胞增殖和抑制细胞凋亡中起着十分重要的作用[9]。基于此，猜测m受体对此信号通路是否也会产生激活作用，结果发现卡巴胆碱处理细胞后诱导了细胞内YAP核转位，具体来说，鉴于S127位点的磷酸化状态是调控YAP进出核的主要因素[10]，YAP的升高和p-YAP（S127）的降低揭示原本在细胞质内分布较多的YAP通过去磷酸化进入细胞核，从而诱导细胞的增殖和侵袭。然而，由于癌症的发生过程不仅仅是单一的信号通路，m受体对OSCC的作用效果及其他作用机制还有待进一步研究。

综上所述，m受体亚型在OSCC细胞中呈明显的差异表达且与预后相关，使用m受体激动剂卡巴胆碱可通过激活YAP从而诱导OSCC细胞的增殖与侵袭。然而，各项基础研究针对m受体对肿瘤的作用尚无定论，不同类型的肿瘤与m受体的相互作用并非一致，可能是由于配体与不同受体亚型结合后会激活不同的信号通路，导致不同的生物学效应。因此，未来的研究中需要结合肿瘤细胞的不同分子亚型来进一步评估m受体的作用。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。