工业大麻秸秆乙醇提取物对大豆胞囊线虫生理生化代谢的影响

李悦，李海燕*，周圆圆，陈井生，于吉东

（1.黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙 江大庆，163319；2.黑龙江省农业科学院大庆分院，黑龙 江大庆，163316）

大豆胞囊线虫（Heterodera glycines,SCN）是大豆根部最为严重的病源之一，严重影响我国东北和黄淮海地区大豆的生产[1]。目前，对线虫的防治多依赖于化学杀线虫剂，虽然防控效果明显，但其带来的环境污染、抗性产生等问题也较为显著，一些高毒、高残留的化学杀线虫剂己陆续在许多国家和地区被禁用[2,3]。近年来，研究发现许多植物体内含有的次生代谢产物具有一定的杀虫抑菌作用[4]。前人研究表明与亚麻、蓖麻等作物轮作后耕层胞囊数量降低了80%以上[5]，刘淑霞[6]等研究表明大麻根和叶的水提物与乙醇浸提物均对SCN 的毒杀效果显著，但并未探究茎秆提取物对大豆胞囊线虫的毒杀效果以及对线虫的生理生化代谢的影响。

工业大麻也称汉麻（Cannabis sativaLinn.），是一年生草本植物[7]，其四氢大麻酚含量低于0.3%，属于无毒品利用价值的大麻类型[8]。据报道，2019年黑龙江省大麻的种植面积超过4 万公顷，占全国种植面积的60%以上，且有不断增加的趋势[9～11]。作者在前期进行的筛选与研究中发现，工业大麻乙醇提取物浓度为9 mg·mL-1时，大豆胞囊线虫J2 的校正死亡率为88.5%。但其对大豆胞囊线虫的作用机理尚不清楚。线虫体内的糖类、脂类和蛋白质是维持自身生命活动中必不可少的物质，其含量变化会影响线虫的抗药性，从而影响大豆胞囊线虫的存活力[12]。昆虫解毒酶系是代谢大量外源和内源物质的异质酶系[13]，其中乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶是昆虫体内主要的解毒酶，具有代谢内外有毒物和维持正常代谢发育的关键作用[14～16]。因此，为了明确工业大麻秸秆乙醇提取物对大豆胞囊线虫的作用机理，本研究利用前期筛选的最优提取条件所获得的乙醇提取物，测定了其对大豆胞囊线虫体内的总糖、甘油和蛋白质含量以及酶活性等生理生化指标的影响，为工业大麻防治大豆胞囊线虫病奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

工业大麻秸秆为庆麻1 号，由黑龙江省农业科学院大庆分院提供。

大豆胞囊线虫3 号生理小种，采自大庆市洪湖基地大豆试验田。

1.2 方法

1.2.1 工业大麻秸秆乙醇提取物制备 取收获后工业大麻秸秆，阴干后使用植物粉碎机粉碎，过40目筛，备用。在预试验基础上，取10 g工业大麻秸秆粉末，加入62%的乙醇，超声辅助提取一定时间，过滤后减压浓缩至膏状，备用。

1.2.2 大豆胞囊线虫二龄幼虫的获得 于5 月25日取表层土下5～10cm 的病土，采用淘洗过筛法分离病土中的胞囊，于体视解剖镜下挑取大小一致的成熟、饱满胞囊，经0.5% NaClO 溶液表面消毒3 min，无菌水冲洗3～5 次后，浸泡在3 mmoL·L-1ZnS04溶液中，于28℃的恒温箱中孵化，每隔24 h 收集一次孵化的二龄幼虫，并及时换水，用无菌水制成2000条·L-1的悬浮液。

1.2.3 大豆胞囊线虫的处理方法 取J2 悬浮液10 mL，常温下1500 r·min-1离心3 min，移除上清液。离心管内加3 mL 浓度为4.3 mg·mL-1的工业大麻秸秆的乙醇提取物，以无菌水作对照，每个处理重复4次。分别处理0、6、12 和24 h 后，于常温下2000 r·min-1离心5 min，移除上清液，收集线虫备用。

1.2.4 大豆胞囊线虫生理生化指标测定 总糖含量测定：采用蒽酮显色法，将经预处理后的大豆胞囊线虫20 mg 置于1.5 mL 离心管内，加入20 μL 蒸馏水和少许石英砂，冰浴下研磨离心取上清液，参照仵均祥等[17]的方法，加入蒽酮试剂后，使用酶标仪测定620 nm 下的吸光值（OD 值），结合糖标准曲线计算线虫体内的实际总糖含量。线虫体内糖含量（μg·mg-1）=从标准曲线中查得糖含量（μg·mL-1）×样品稀释倍数（mL）/线虫重量（mg）。

可溶性蛋白测定：采用考马斯亮蓝G250 染色法，将经预处理后的大豆胞囊线虫20 mg 置于1.5 mL 离心管内，加入20 μL PBS 缓冲液（磷酸盐缓冲液）和少许石英砂，冰浴下研磨离心取上清液，参照路平[18]方法，加入G250 染色后，使用酶标仪测定595 nm 下的吸光值（OD 值），结合可溶性蛋白标准曲线计算线虫体内的实际可溶性蛋白含量。线虫体内可溶性蛋白（μg·mg-1）=从标准曲线中查得可溶性蛋白含量（μg·mL-1）×样品稀释倍数（mL）/线虫重量（mg）。

甘油含量测定：采用高碘酸钠氧化法，线虫体内甘油的提取方法同可溶性蛋白的处理，参照刘丹丹[19]方法，加入甘油显色剂后，使用酶标仪测定420 nm 下的吸光值（OD 值），结合甘油标准曲线计算线虫体内的实际甘油含量。线虫体内甘油（μg·mg-1）=从标准曲线中查得甘油含量（μg·mL-1）×样品稀释倍数（mL）/线虫重量（mg）。

羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性测定：采用北京索莱宝科技有限公司生产的试剂盒，相应酶液的提取及酶活测定均参照说明书进行。

1.2.5 数据分析 采用Microsoft Excel 2003 进行数据的录入、整理，用DPS软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 工业大麻秸秆乙醇提取物对大豆胞囊线虫J2总糖含量的影响

随着处理时间的延长，乙醇提取物处理大豆胞囊线虫J2 总糖含量呈上升趋势，而CK 总糖含量稍有下降（图1）。浸泡6 h时，线虫J2总糖含量上升情况与CK 间差异不显著。处理12 h 时，J2 总糖含量稍有上升，J2 总糖含量为27.18 μg·mg-1，与CK 相比总糖含量高24.6%，差异显著。处理24 h 时，J2 总糖含量上升较快，为40.74 μg·mg-1，与CK 相比总糖含量上升了96.2%，与CK 间存在极显著差异。随处理时间的延长CK 的总糖含量虽有不同程度的降低，但均未达到显著水平，经工业大麻秸秆乙醇提取物处理后的J2 总糖含量随处理时间的延长有显著或极显著上升，与处理6h 相比，处理12 h 和24 h后的J2体内总糖含量分别升高了49.9%、79.0%。

图1 工业大麻秸秆乙醇提取物处理后大豆胞囊线虫J2总糖含量Fig.1 Total sugar content of soybean cyst nematode J2 treated with ethanol extract of industrial hemp straw

2.2 工业大麻秸秆乙醇提取物对大豆胞囊线虫J2可溶性蛋白含量的影响

随着工业大麻秸秆乙醇提取物处理时间的延长，大豆胞囊线虫J2 可溶性蛋白含量与CK 均有不同程度降低（图2）。经处理6 h时，线虫J2体内可溶性蛋白含量下降情况与CK 间差异不显著。处理12 h 时，J2 体内可溶性蛋白含量下降较快，可溶性蛋白含量为18.36 μg·mg-1，与CK 相比降低了18.3%，差异极显著。处理24 h 后，J2 体内可溶性蛋白含量持续下降，为15.34 μg·mg-1，与CK 相比降低了26.3%，与CK间存在极显著差异。随处理时间的延长CK 的可溶性蛋白含量虽有不同程度的降低，但均未达到显著水平，经工业大麻秸秆乙醇提取物处理后的J2 可溶性蛋白含量随处理时间的延长均有显著或极显著差异下降，与处理6 h 相比，处理12 h和24 h 后的J2 体内可溶性蛋白含量分别降低17.6%、31.1%。

图2 工业大麻秸秆乙醇提取物处理后大豆胞囊线虫J2可溶性蛋白含量Fig.2 Soluble protein content of soybean cyst nematode J2 treated with ethanol extract of industrial hemp straw

2.3 工业大麻秸秆乙醇提取物对大豆胞囊线虫J2甘油含量的影响

随着工业大麻秸秆乙醇提取物处理时间的延长，大豆胞囊线虫J2体内甘油含量与CK均呈上升趋势（图3）。当处理6 h时，线虫J2体内甘油含量变化与CK间差异不显著。处理12 h时，J2体内甘油含量上升较快，为0.12 μg·mg-1，与CK相比甘油含量上升了24.4%，差异极显著。处理24 h后，J2体内甘油含量持续上升，为0.14 μg·mg-1，与CK相比甘油含量上升了33.5%，差异极显著。经工业大麻秸秆提取物处理12 h 和24 h 后的J2 甘油含量极显著高于处理6 h后的J2甘油含量，分别升高29.0%、44.7%。

图3 工业大麻秸秆乙醇提取物处理后大豆胞囊线虫J2甘油含量Fig.3 Glycerin content of soybean cyst nematode J2 treated with ethanol extract of industrial hemp straw

2.4 工业大麻秸秆乙醇提取物对大豆胞囊线虫J2乙酰胆碱酯酶（AchE）活性的影响

随着工业大麻秸秆乙醇提取物处理时间的延长，大豆胞囊线虫J2 乙酰胆碱酯酶活性变化呈下降趋势（图4）。当处理6 h时，线虫J2乙酰胆碱酯酶活性稍有降低，但与CK 间差异不显著。处理12 h 时，J2 乙酰胆碱酯酶活性降低较快，为1093.68 U·g-1，与CK 相比乙酰胆碱酯酶活性降低了58.3%，差异极显著。处理24 h 后，J2 乙酰胆碱酯酶活性持续降低，为377.71 U·g-1，与CK 相比乙酰胆碱酯酶活性降低了61.1%，与CK 间存在极显著差异。随处理时间延长，CK 的J2 乙酰胆碱酯酶活性稍有降低，但均未达到显著水平。经工业大麻秸秆乙醇提取物处理后的J2 乙酰胆碱酯酶活性极显著降低，与处理6 h 时相比，处理12 h 和24 h 后的J2 体内乙酰胆碱酯酶活性分别降低了50.3%、58.9%。

图4 工业大麻秸秆乙醇提取物处理后大豆胞囊线虫J2乙酰胆碱酯酶活性Fig.4 AchE activity of soybean cyst nematode J2 treated with ethanol extract of industrial hemp straw

2.5 工业大麻秸秆乙醇提取物对大豆胞囊线虫J2羧酸酯酶（CarE）活性的影响

随着工业大麻秸秆乙醇提取物处理时间的延长，大豆胞囊线虫J2 羧酸酯酶活性呈下降趋势（图5）。经处理6 h 时，线虫J2 羧酸酯酶活性降低情况与CK 间差异不显著。处理12 h 时，J2 羧酸酯酶活性降低较快，为15.33 U·g-1，与CK 相比羧酸酯酶活性降低了41.8%，达极显著差异。处理24 h 时，J2羧酸酯酶活性持续降低，为13.00 U·g-1，与CK 相比羧酸酯酶活性降低了51.3%，差异极显著。CK的J2羧酸酯酶活性随时间的延长虽有不同程度的降低，但均未达到显著水平；经工业大麻秸秆乙醇提取物处理12 h 和24 h 时的J2 羧酸酯酶活性与6 h 时相比差异极显著，分别降低了42.7%、51.4%。

图5 工业大麻秸秆乙醇提取物处理后大豆胞囊线虫J2羧酸酯酶（CarE）活性Fig.5 CarE activity of soybean cyst nematode J2 treated with ethanol extract of industrial hemp straw

2.6 工业大麻秸秆乙醇提取物对大豆胞囊线虫J2谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性的影响

随着工业大麻秸秆乙醇提取物处理时间的延长，大豆胞囊线虫J2谷胱甘肽S-转移酶活性呈下降趋势（图6）。经工业大麻秸秆乙醇提取物处理6 h、12 h 时，线虫J2 谷胱甘肽S-转移酶活性分别为0.46 U·g-1、0.44 U·g-1，与CK 间差异均不显著。处理24 h 后，线虫J2 谷胱甘肽S-转移酶活性降低较快，为0.24 U·g-1，与CK 相比谷胱甘肽S-转移酶活性降低了45.4%，达极显著差异。CK 线虫J2 谷胱甘肽S-转移酶活性随时间延长稍有降低，但无显著差异。经工业大麻秸秆乙醇提取物处理后的J2 谷胱甘肽S-转移酶活性极显著降低，与处理6 h 时相比，处理12 h和24 h后的J2谷胱甘肽S-转移酶活性分别降低了5.3%、44.6%。

图6 工业大麻秸秆乙醇提取物处理后大豆胞囊线虫J2谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性Fig.6 GST activity of soybean cyst nematode J2 treated with ethanol extract of industrial hemp straw

3 讨论与结论

糖类是线虫体内重要的储能物质，而蛋白质是线虫体表的防御性角质层的重要组成部分，其结构和功能被破坏后，会影响大豆胞囊线虫的抗药性，从而降低大豆胞囊线虫的存活力[12]。本试验结果表明，线虫在工业大麻秸秆乙醇提取物作用时，引起总糖含量上升，这与路平[18]研究的生防细菌X-20对根结线虫生防机制中总糖含量的变化趋势相同，工业大麻秸秆乙醇提取物处理线虫后，促进了线虫体内糖的合成，导致线虫体内糖代谢出现紊乱，从而削弱线虫抵御不良环境的能力。可溶性蛋白含量和甘油含量下降，与刘丹丹[19]报道的酸类化合物处理大豆胞囊线虫后变化趋势一致。表明工业大麻秸秆乙醇提取物可能是抑制了线虫体内可溶性蛋白的合成，影响线虫虫体角质层的形成，降低线虫的抗逆能力最终致其死亡。甘油除作为线虫体内能源物质外，也是参与抗逆机制的重要组成部分[20]。经工业大麻秸秆乙醇提取物处理后，线虫体内的甘油含量增加，说明线虫体内的甘油可能参与了线虫的抗逆反应。

乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶是昆虫体内主要的解毒酶，经工业大麻秸秆乙醇提取物处理后，线虫的乙酰胆碱酯酶活性明显降低，这与刘琼[21]等报道的球孢白僵菌次生代谢产物处理南方根结线虫后变化趋势相同。说明工业大麻秸秆乙醇提取物可导致线虫虫体的神经递质无法正常降解，造成其神经系统紊乱，最终导致线虫死亡。另外昆虫的代谢抗药性与羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶有关[22]，张楠[23]研究发现大豆荚壳提取物处理根结线虫后谷胱甘肽S-转移酶活性显著低于对照。本研究发现工业大麻秸秆乙醇提取物处理线虫后可使其体内的羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶活性下降，削弱其对毒害物质的降解，使线虫无法正常的生长发育，最终导致线虫死亡。

本研究明确了工业大麻秸秆乙醇提取物能够使线虫体内糖、蛋白质和脂类物质代谢出现紊乱，破坏线虫虫体结构，使其生存能力下降。同时乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶活性受到抑制，使线虫代谢有毒物质能力减弱，从而起到毒杀线虫的作用。但是，关于工业大麻秸秆乙醇提取物中有效杀线虫活性成分的结构以及影响线虫代谢的分子机制还有待进一步研究，以期开发出新型的植物源杀线虫剂，减少化学农药的使用量。