氯胺酮麻醉对大鼠认知功能的影响及作用机制

李峰 甘建辉 董文岳 王艺 刘锋 李永强

术后认知障碍是临床上常见的并发症之一，严重影响患者的生存质量，研究表明术后并发症与麻醉药品的使用、引发神经功能的损伤有关[1,2]。老年人群神经系统较为脆弱，婴幼儿神经系统较为敏感，均为术后认知功能的易发人群[3]。氯胺酮是临床上常见的静脉麻醉类药物，具有良好的镇静、麻醉效果，但对神经系统可能造成一定的损伤，对认知功能造成一定的损伤，使用方面存在一定的争议[4,5]。目前对于麻醉药对中枢神经系统的作用机制尚不明确，目前主要认为的机制为细胞启动自杀式程序，改变神经递质传到，引发神经细胞凋亡有关等[6,7]。为进一步探讨氯胺酮对大鼠认知功能的影响及其作用机制，本实验以40只大鼠为研究对象，主要通过Morris 水迷宫、TUNEL法考察氯胺酮对认知功能的影响，并对其机制进行研究，进而为临床麻醉合理用药提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取鼠龄1周的健康大鼠40只(SPF级雄性，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK2019-0008)，体重约为15 g，由山东动物实验动物研究中心提供，均通过了认知功能及运动功能测试，将大鼠至于自然昼夜光照，温度25℃，湿度40.0%～50.0%条件下饲养1周，消除周围环境影响，将大鼠随机分为A、B、C、D组，每组10只。A组为对照组，注射同等剂量的等渗0.9%氯化钠溶液，B组注射50 mg/kg的氯胺酮，C组注射75 mg/kg的氯胺酮，D组注射100 mg/kg的氯胺酮[8]，以后每小时追加一半的剂量进行麻醉维持，所有操作符合动物伦理学会要求，善待动物，降低对动物的伤害。大鼠的鼻唇、趾端肤色保持红润，4组体重、呼吸频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 4组大鼠的基本信息

1.2 方法

1.2.1 水迷宫实验：以高0.5 m、宽1.2 m的水池建立水迷宫，按顺时针方向分为4个象限，将水池及平台及水均染成黑色，平台固定于第3象限水下1 cm处，水温控制为25℃左右，麻醉前1 d使大鼠置于水迷宫中试游5 min，以适应周围环境，氯胺酮麻醉后的10 h进行定位航行实验，历时5 d，分别记录为D1～D5，每天上下午各训练2次，将大鼠面向池壁从不同象限滑入水池，记录大鼠寻找到平台的时间，若2 min内未找到平台，则对大鼠进行指引，于平台处休息20 s，进行下一轮的训练。第6天进行空间探索实验，撤去平台，选一任意点作为入水点，记录2 min内大鼠在平台所在象限的停留时间，整个实验过程中，保持整体环境一致，以排除外界干扰。

1.2.2 海马区神经细胞元凋亡测定：采用TUNEL法进行神经元凋亡的测定，主要通过试剂盒进行测定，使用并与标准图像及逆行对比分析，以细胞核中出现黄色颗粒为判断标准。

1.2.3 Fas蛋白测定：使用试剂盒对Fas蛋白含量进行测定，严格按照说明及逆行操作，以海马神经元细胞是否出现黄色作为判断依据，使用图像分析仪进行观测。

2 结果

2.1 水迷宫测试 对4组大鼠进行了水迷宫测试，进而对大鼠的空间学习能力及空间记忆能力及逆行考察。对小鼠的运动轨迹进行研究分析。见图1。

2.1.1 空间学习能力：本次实验通过定位航行实验对大鼠的空间学习能力进行了考察。4组小鼠逃逸时间均随着时间的延长而缩短，C、D组大鼠的逃逸时间均明显长于A组(P<0.05)；B组与A组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，B、C、D组间差异有统计学意义(P<0.05)。中、高剂量的氯胺酮会对大鼠学习能力造成一定的影响。见表2，图2。

表2 4组大鼠的逃逸时间比较

2.1.2 空间探索能力：本次实验通过空间探索实验，对大鼠的空间探索能力进行了考察。A、B、C、D组在原平台象限停留时间依次减少，差异有统计学意义(P<0.05)。氯胺酮对大鼠的空间探索能力具有一定的影响，且与剂量呈依赖关系，剂量越大，对大鼠空间探索能力的损伤越大。见表3。

2.2 海马区神经元凋亡 对4组大鼠海马区神经元的凋亡情况，进行研究分析。A、B、C、D组神经元凋亡率依次增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

图2 4组大鼠的逃逸时间比较

表3 4组小鼠的平台所在象限停留时间

表4 4组大鼠的神经元凋亡情况

2.3 Fas蛋白表达 对4组大鼠的Fas蛋白表达情况进行研究分析。A、B、C、D组Fas蛋白表达量依次增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3，表5。

表5 4组大鼠Fas蛋白表达情况

3 讨论

氯胺酮是常见的一种镇静麻醉药，已被普遍运用于内外科手术治疗之中，具有良好的镇静、麻醉效果，但容易对神经系统造成一定的伤害，对记忆及认知造成一定的影响[8,9]。氯胺酮对神经功能的伤害尚不明确，可能与氯胺酮在一定程度上会引起神经元细胞的凋亡有关，进而影响大鼠的认知功能。氯胺酮的神经功能损伤副作用成为阻碍该类药品应用的重要原因，是麻醉科急需解决的问题之一[10]。在对大鼠的认知及学习能力研究中，主要采用经典的Morris水迷宫实验，通过测定逃避潜伏期，测定大鼠的认知及记忆保持能力。本次研究中，氯胺酮注射剂量越少，潜逃时间越短，说明氯胺酮对大鼠的认知功能造成一定影响，且浓度越高影响越大。Schumacher等[11]对氯胺酮对大鼠认知功能的影响进行了分析研究，结果表明氯胺酮会对大鼠的认知功能造成一定的损害，且与剂量密切相关，剂量越大，所造成的损伤往往越严重。李桂婷等[12]对氯胺酮对幼年小鼠空间学习记忆功能进行了研究分析，将小鼠随机分为了对照组及氯胺酮组，结果表明氯胺酮组小鼠的学习记忆功能衰退，小鼠的神经元存在一定的损伤。黄丹等[13]对氯胺酮在老龄大鼠认知功能损伤的作用与机制进行了研究分析，将42只大鼠分为不同的组别，给予不同剂量的氯胺酮进行研究分析，结果表明氯胺酮会损伤大鼠的认知功能，且呈浓度依赖性。以上研究均提示氯胺酮会对大鼠的认知功能造成一定的损伤且与剂量密切相关，在氯胺酮的使用中应严格把控用药剂量，在保证治疗效果的前体下尽量减少用药，进而降低对认知功能的损伤。

Fas蛋白又称为细胞表面蛋白，主要参与细胞的凋亡过程。研究表明，Fas蛋白所介导的细胞凋亡是海马神经元损伤的重要机制之一，往往神经元损伤较为严重的部位，该蛋白表达含量较高[14]。氯胺酮不仅会对大鼠认知功能造成一定的影响，影响海马区域相关蛋白的表达[15]。马飞等[16]对脑损伤大鼠Fas的含量水平进行了研究分析，结果表明Fas蛋白表达水平与神经元的损伤密切相关，神经损伤越严重，Fas表达水平往往越高。曹进丽[17]对Fas与神经元细胞凋亡间的联系进行了研究分析，结果表明Fas的过量表达是促进神经元细胞凋亡重要原因之一。在本次研究中对大鼠Fas蛋白表达情况进行研究分析，注射氯胺酮后，大鼠的Fas蛋白表达水平明显升高。Fas蛋白升高可能是神经元受损，进而影响认知功能的重要原因[18-23]。

综上可知，氯胺酮对大鼠的认知功能具有一定的损伤作用，这可能与海马区的Fas蛋白分泌增高，促进神经元细胞凋亡有关[24-27]，在今后氯胺酮的使用过程中，应严格控制使用剂量，降低对认知功能的影响。