CGF、PRF和PRP中各种生长因子定量分析

韩尚志 兰玲莉 刘锐 孟凡利 陈喜波

血小板作为全血中最重要的组成部分之一，富含多种生长因子(GF)，例如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGFβ-1)、血小板衍生生长因子(PDGF-AB)、表皮生长因子(EGF)等。血小板可释放多种因子在生理情况下发挥黏附、聚集、释放及收缩功能，能参与机体凝血机制，且还在血栓形成、炎性反应及免疫反应等过程中发挥重要作用[1]。而富血小板血浆(PRP)作为第一代血小板浓缩物，是将新鲜全血通过特定离心方式得到的含高浓度血小板的血浆。在 1998 年 Marx 首先将 PRP 应用于骨重建中。因其富含高浓度的血小板，含有高浓度促进骨组织和软骨组织再生修复的生长因子，对骨再生和伤口愈合有积极的作用[2]；富血小板纤维蛋白(PRF)是在 PRP 基础上最早在法国由Choukroun等[3]提出的第二代血小板浓缩物。是在 PRP 的基础上，在无任何化学添加剂的情况下制得的富含血小板的纤维蛋白，纤维蛋白的聚合过程类似于自然形成的过程，这样一个纤维蛋白网络将导致一个更高效的细胞迁移和增殖，且能缓慢释放生长因子，延长作用时间从而促进伤口组织愈合；浓缩生长因子(CGF)是继 PRP、PRF 之后第三代血小板浓缩物，是利用血液样本和特殊的离心设备制备而出的更大、富含更高浓度生长因子的纤维蛋白团块，故这些团块具有更好的促再生能力和可塑性，更易于吸收[4]。PRP、PRF、CGF 作为血浆提取物研究的三个阶段的产物，有着各自不同的临床价值与应用[5]。理论上讲，CGF由于特殊离心过程使其比其他血小板浓缩物似乎含有更加丰富的生长因子。但是很少有研究来支持这一观点。本研究的目的是评价CGF中主要生长因子的含量，并与PRP和PRF中的生长因子进行比较。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取20名身体健康的志愿者，男12名，女8名，平均年龄41.3岁。

1.2 纳入标准 (1)所有志愿者都被告知实验的性质，并签署知情同意书。(2)志愿者均无全身系统性疾病，非孕妇或哺乳期女性。(3)过去3个月内未服用任何影响血小板数量或功能药物的患者，实验室检查显示血小板计数正常。

1.3 PRP的准备 在晨起空腹状态下抽取志愿者静脉血10 ml，将血液收集到含有10%柠檬酸三钠溶液作为抗凝血剂的无菌离心管中(Greiner Bio-One,GmbH,Kremsmunster,Austria)。将试管以1 600 r/min离心6 min，这时离心管中的血液样本分成两层，上层是血浆、血小板和白细胞的混合物，下层是红细胞。然后抽取上层和下层上3 mm红细胞的血样本，以900 r/min离心10 min，从而使得两层分离，上层为缺血小板血浆(PPP)，下层为PRP(浓缩血小板、少量红细胞和白细胞的混合物)。将大部分PPP抽取出来储存在-80℃以供使用。将剩下的2 mm PPP和PRP混合收集。将含有1 000 U/ml牛凝血酶的10%氯化钠容易以10∶1的比例混入到PRP试管中，在4℃条件下存储12 h，然后以1 000 r/min的速度离心20 min，吸取上清液，在-80℃保存以用来测定生长因子的含量。

1.4 CGF的制备 在早晨空腹的情况下抽取志愿者静脉血10 ml。将血液收集到不含抗凝剂的专用无菌离心管中(Greiner Bio-One，GmbH，Kremsmunster，Austria)中。然后使用CGF变速离心机离心(Medifuge，Silfradentsrl，索非亚，意大利)，方法为：加速30 s，2 700 r/min 2 min，2 400 r/min 4 min，2 700 r/min 4 min，3 000 r/min 3 min，然后减速36 s后停止。这时离心管中的血液样本分为三层：(1)上层主要成分为血清为主(无纤维蛋白原和凝血因子的血液血浆，贫血小板血浆，PPP)；(2)中层包含CGF，白细胞和干细胞以及聚合纤维蛋白；(3)下层为红细胞(RBC)层。抽吸PPP层并保存在-80℃下。在接近红色界面处的CGF切成1～2 mm的小块，并转移至低温小瓶中，将小瓶浸入液氮中5 min，然后在37℃下快速加热5 min，反复3次。然后将小瓶在4°C(Eppendorf离心机，德国)中以1 000 g离心20 min。吸出上清液并储存在-80℃下以测量生长因子。

1.5 PRF的准备 在早晨空腹的情况下抽取志愿者静脉血10 ml将血液收集到不含抗凝剂的专用无菌离心管中(Greiner Bio-One，GmbH，Kremsmunster，Austria)中。 通过将血液以2 700 r/min的速度离心12 min(德国，埃彭多夫)获取PRF。 离心后血液样本分为三层：上层为PPP层，中层为纤维蛋白凝块(PRF)层，底部的RBC层。抽吸PPP层并保在-80℃下。在接近红色界面处的CGF切成1～2 mm的小块，并转移至低温小瓶中。将小瓶浸入液氮中5 min，然后在37℃下快速加热5 min，反复此过程三次。 然后将小瓶在4℃(Eppendorf离心机，德国)中以1 000 g离心20 min。 吸出上清液并储存于-80℃以测量生长因子。

1.6 量化生长因子 使用ELISA法评价了血小板中5个代表性生长因子的水平：血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)，转化生长 β-1(TGF-β1)，胰岛素样生长因子-1(IGF1)，血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。 使用酶标仪(Bio-Rad，美国)在450 nm波长吸收下测量OD值。 根据制造商的说明测量生长因子的浓度。 对所有测定重复3次。

2 结果

2.1 3组PDGF-BB水平比较 3组间上层、中间层中PDGF-BB水平比较，差异均无统计学意义(P> 0.05)。组中间层PDGF-BB的水平均高于上层，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组PDGF-BB水平比较

2.2 3组TGF-β1水平比较 3组间上层、中间层TGF-β1水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。3组中间层TGF-β1水平均高于上层，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组TGF-β1水平比较

2.3 3组IGF-1水平比较 3组组间上层、中间层IGF-1水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，3组中间层IGF-1水平高于上层，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组IGF-1水平比较

2.4 3组VEGF水平比较 3组组间上层、中间层VEGF水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，3组中间层IGF-1水平高于上层，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 3组VEGF水平比较

2.5 3组bFGF水平比较 3组PPP层bFGF水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，PRF组、CGF组中间层bFGF水平明显高于PRP组(P<0.01)，PRF组中间层bFGF水平与CGF组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 3组bFGF浓度值水平比较

3 讨论

本实验旨在研究测量CGF和其他血小板提取物中生长因子释放浓度的可用数据。本研究证明了CGF是浓缩生长因子的混合物。 但是，五种比较活跃的生长因子中，我们检测到只有bFGF因子在CGF和PRF中明显高于PRP。

3.1 实验方法 PRP是血液借助外源性牛凝血酶而引发快速凝结过程产生的，其中的生长因子在凝结后10 min内开始分解，超过95%的预合成生长因子在1 h内被分解[16]，作用时间短暂。与PRP不同，CGF中的生长因子在凝结后不会立刻溶解，基质添加物中的强纤维蛋白凝胶会缓慢地重塑[6]。与PRF相比，交替和可控的离心速度可以分离更大，更密的纤维蛋白基质，形成纤维网格起到存储作用，大量血小板夹在纤维蛋白网络中，这使得生长因子的释放更加缓慢。因此，CGF延长了生长因子活性的持续时间。研究发现PRF可以在至少一周内的时间持续释放生长因子[7]。刘琳等[8]证明CGF可以在至少13 d内持续释放TGF-β1。此外，CGF制备过程中的离心分离步骤可以使血小板不断碰撞和破裂，这也将改善生长因子的释放[9]。因此从理论上讲，CGF可以成为功能强大的生物支架，具有完整的生长因子库。

研究表明，冻融法作为一种纯粹的物理方法可以安全有效地激活血小板[10]。研究发现两种PRP中PDGF-AA和TGF-β1的浓度之间没有显著差异[11]。在另一项研究中，Wen等[12]证明了冻融激活和凝血酶激活的PRP均可促进人类牙髓细胞的增殖。此外，前者对细胞增殖的刺激作用强于后者。但是，一些作者发现血小板的激活方法在生长因子释放方面有所不同。 Textor等[13]通过四种方法激活PRP：自体凝血酶，牛凝血酶，氯化钙(CaCl2)或冻融法，结果表明，CaCl2激活PRP所产生的PDGF-BB释放量明显高于其他任何方法。通过四种不同的方法激活PRP后，TGF-β1的释放具有可比性。需要更复杂的研究来识别或解释不同文献之间的差异。

Nishimoto等[14]发现，PRF底部的生长因子浓度最高。 他们的组织学观察表明，血小板在PRF的黄色和红色部分密集。 Rodella等[15]评估了CGF中TGF-β1和VEGF的表达，免疫组织化学结果显示CGF和RBC层均存在广泛的免疫染色。 在本研究中，红色界面的纤维蛋白阻滞被切为PRF或CGF。 冻融活化方法避免溶血之前，应丢弃RBC层的大部分。存储在RBC层中的生长因子可能会部分丢失，这可能会影响结果，造成实验误差。

3.2 研究结果 在本研究中，我们清楚地证明了PRP，PRF和CGF含有丰富的生长因子。众所周知，这些生长因子能有效促进组织愈合和再生。有实验验证，在牙周炎患者牙根表面涂抹各种浓度的PDGF-BB，并在24 h后观察成纤维细胞的黏附性和细胞形态。结果表明，PDGF-BB诱导牙周膜成纤维细胞黏附牙根表面的最佳浓度为50 ng/ml[16]。 IGF-1对成骨细胞也具有剂量依赖性的趋化作用。PRP，PRF和CGF也有类似的趋势。在体外，PRP中的血小板浓度与成人间充质干细胞的增殖，成纤维细胞的增殖以及I型胶原的产生存在剂量反应关系[17]。在体内，PRP可能以剂量依赖的方式在一定水平上对肠道吻合愈合产生积极影响，但当其高度浓缩时会产生不利影响。在先前的研究中，证明了在一定浓度下，CGF以剂量依赖性方式显着促进人牙周膜细胞的增殖和碱性磷酸酶活性[18]。在未来的研究中，我们需要更多的数据来找到适合于不同临床应用的血小板浓缩液的合适治疗剂量。

本实验表明， CGF中含有大量PDGF-BB，TGF-β1，IGF-1，VEGF和bFGF。 此外，CGF和PRF中的bFGF水平明显高于活化PRP中的bFGF水平。 作为生长因子的储存载体，CGF是组织工程和再生的新应用。 CGF的简便性和快速性为临床应用带来了希望。 以后需要进行更多精心设计的研究，以提供有关CGF伤口愈合和组织再生能力的确凿证据。