肉桂-山苍子复合植物精油微胶囊的制备工艺优化

霍珊珊，王若兰，吕好新，赵玲丽，刘怡君

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

植物精油是一类以蒸馏、萃取等方式从植物的根、茎、叶、花及种子等部位提取的次生代谢物质[1-3]，其抑菌成分主要是醛、酚、萜烯类化合物和醇类，具有广谱抗菌性且易于生物降解，在粮食和食品的防霉、保鲜等方面有着较高的应用价值[4-5]。许国娟等[6]发现肉桂精油可显著抑制柑橘病原菌如指状青霉、意大利青霉和地霉菌株等的孢子萌发和菌丝生长。卢锟等[7]发现山苍子精油对大米中青霉和黑曲霉表现出较好的抑菌效果。植物精油的抑菌活性虽好，但挥发性较强，导致抑菌持续时间短暂，抑菌效果大打折扣。该缺点使植物精油在粮食储藏和食品保鲜领域的应用受到了一定的限制。目前，可将植物精油制成微胶囊，达到延缓挥发速率、减少有效成分流失、提高抑菌稳定性、便于运输保存等目的[8-11]。

微胶囊技术是一种利用天然或合成的高分子材料,将固体或液体物质包埋起来,形成具有半通透性或密封囊膜微型胶囊的微包装技术[12]。β-环糊精是由7个葡萄糖分子结合而成的稳定性较强的环状结构化合物，具备外部亲水和内部疏水结构，能够将精油等非极性分子包埋在内部疏水空腔内，从而增加包埋物的稳定性，并延缓其释放速率[13-15]。此外，β-环糊精在人体内能被吸收、分解，安全无毒，不会造成粮食和食品化学物残留等问题[16]。作为一种性能优良的微胶囊壁材，现已有研究使用β-环糊精成功制备牛至精油微胶囊、油茶色素微胶囊、猕猴桃籽油微胶囊等[17-19]。作者以β-环糊精为壁材，肉桂-山苍子复合植物精油(CLCEO)为芯材，探索并优化了肉桂-山苍子复合植物精油微胶囊(CLCEOM)的制备工艺，旨在将CLCEOM用作粮食储藏防霉剂，为其在粮食储藏领域的应用奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肉桂、山苍子精油：江西省吉安市中香植物有限公司；β-环糊精：食品级，北京索莱宝科技有限公司；95%乙醇、无水乙醇：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ML-204电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HH-4J数显恒温水浴锅：上海维诚仪器有限公司；LGJ-10C四环冻干机：北京四环科学仪器厂有限公司；TU-1810紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；Quanta 250 FEG扫描电子显微镜：美国FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 CLCEOM的制备

CLCEOM的制备参考俞露等[20-21]的方法并加以修改。准确称取1 gβ-环糊精加入45 mL水中，在300 r/min、50 ℃磁力搅拌水浴锅中搅拌30 min，制成β-环糊精水溶液。将0.34 g肉桂-山苍子复合植物精油溶于5 mL无水乙醇，水浴温度设置成包埋时所需温度，然后将5 mL肉桂-山苍子复合植物精油乙醇溶液逐滴缓慢加入45 mLβ-环糊精水溶液中，以300 r/min搅拌包埋120 min，转移至4 ℃冰箱沉降48 h，之后弃去上清液，用无水乙醇洗涤3次，洗去吸附在β-环糊精空腔外部的复合植物精油，再将其放入真空冷冻干燥机中冻干，得到干燥的CLCEOM粉末。

1.3.2 包埋率的测定

CLCEO标准曲线的制作：取0.1 g CLCEO，用95%乙醇分别配制质量浓度为2、4、6、8、10 μg/mL的肉桂-山苍子复合植物精油乙醇溶液，在280 nm处测定吸光度，并绘制标准曲线。

CLCEOM中精油含量的测定[22-25]：准确称取0.05 g CLCEOM粉末，加入5 mL 95%乙醇，浸泡24 h使其充分溶解，然后用0.22 μm微孔过滤器过滤，收集滤液，定容至10 mL。用95%乙醇10倍稀释2次后，在280 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算CLCEO的含量。

包埋率为包埋后微胶囊中肉桂-山苍子复合植物精油质量与最初加入的肉桂-山苍子复合植物精油质量的比值[26-27]。

1.3.3 单因素试验

以β-环糊精为壁材、CLCEO为芯材，按照1.3.1的方法制备CLCEOM，研究壁材添加量、壁芯比、包埋温度和包埋时间等4个因素对微胶囊包埋率的影响，从而确定CLCEOM制备工艺的初步取值。

1.3.3.1 壁材添加量

设定壁芯比3∶ 1，包埋温度50 ℃，包埋时间120 min，壁材添加量分别为2%、6%、10%、14%、18%，即50 mL体系中有1、3、5、7、9 gβ-环糊精，研究壁材添加量对包埋率的影响。

1.3.3.2 壁芯比

设定壁材添加量6%，包埋温度50 ℃，包埋时间120 min，壁芯比分别为1∶ 1、3∶ 1、5∶ 1、7∶ 1、9∶ 1、11∶ 1，研究壁芯比对包埋率的影响。

1.3.3.3 包埋温度

设定壁材添加量6%，壁芯比3∶ 1，包埋时间120 min，包埋温度分别为30、35、40、45、50、55、60 ℃，研究包埋温度对包埋率的影响。

1.3.3.4 包埋时间

设定壁材添加量6%，壁芯比3∶ 1，包埋温度50 ℃，包埋时间分别为60、90、120、150、180 min，研究包埋时间对包埋率的影响。

1.3.4 响应面试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验原理，以包埋率为响应值，选择合适的因素与水平设计响应面优化试验，确定CLCEOM的最佳制备工艺。根据响应面试验优化得到最佳制备条件，进行验证试验，重复3次。

1.3.5 微观形态观察

取少量β-环糊精和CLCEOM粉末样品，在铝制样品台的导电胶上粘牢，并用洗耳球吹去多余粉末，喷金处理，扫描电子显微镜下观察微观形态。

1.4 数据处理

各组试验均进行平行试验(n=3)，结果以平均值±标准差表示。使用SPSS 20.0、Excel 2016和Origin 2018软件进行数据分析及制图，用Duncan’s法进行显著性分析，用Design-Expert 8.0.6进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 CLCEO标准曲线的制作

以CLCEO质量浓度为横坐标，其在280 nm处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，结果如图1所示，通过线性回归得到标准曲线方程为Y=0.079 83X+0.008 78，R2=0.998 42，表明标准曲线拟合效果较好。

图1 CLCEO的标准曲线Fig.1 Standard curve of CLCEO

2.2 单因素试验

2.2.1 壁材添加量对包埋率的影响

壁材添加量对包埋率的影响如图2所示，随着β-环糊精添加量的增大，包埋率呈现先上升后下降的趋势，这可能是当β-环糊精的添加量比较低时，大量的芯材没有被包埋到，仅能制备出少量的微胶囊，而添加量过大时，会造成溶液的黏度增大，导致对芯材复合植物精油的包埋不充分[28-29]。壁材添加量为10%时，包埋率最高，为39.4%，因此确定最适壁材添加量为10%。

图2 壁材添加量对包埋率的影响Fig.2 Effect of wall addition on the embedding rate of CLCEOM

2.2.2 壁芯比对包埋率的影响

壁芯比对包埋率的影响如图3所示，随着壁芯比的增加，微胶囊的包埋率不断升高，但升高速率逐渐趋于平缓。当壁芯比为9∶ 1时，包埋率为54.65%；壁芯比为11∶ 1时，包埋率为55.75%，两者之间的差距不显著，这可能是当壁芯比达到一定比例时，β-环糊精在体系中已经接近饱和，壁芯比继续增大，对包埋率产生的影响越来越小。因此，确定最适壁芯比为9∶ 1。

图3 壁芯比对包埋率的影响Fig.3 Effect of the wall-core ratio on the embedding rate of CLCEOM

2.2.3 包埋温度对包埋率的影响

包埋温度对包埋率的影响如图4所示，微胶囊的包埋率随着包埋温度的升高先增大后下降。当包埋温度高于35 ℃时，包埋率降低，这可能是过高的包埋温度破坏肉桂-山苍子复合植物精油乙醇溶液的稳定性，造成芯材损失，从而导致包埋率下降。包埋温度在35 ℃时，包埋率最高，因此确定最适包埋温度为35 ℃。

图4 包埋温度对包埋率的影响Fig.4 Effect of embedding temperature on the embedding rate of CLCEOM

2.2.4 包埋时间对包埋率的影响

包埋时间对包埋率的影响如图5所示，在设置的包埋时间范围内，包埋率随着包埋时间先降低再增大后减小。当包埋时间为90 min时，包埋时间过短，复合植物精油与β-环糊精的接触不充分，植物精油的包埋率最低，为13.22%；当包埋时间为120 min时，包埋率达到最大值，为16.61%，两种条件下的包埋率相差不大，相较于其他因素，包埋时间对包埋率影响较小，故响应面试验中不再考虑。再延长包埋时间，会造成植物精油挥发，破坏其与β-环糊精之间的疏水作用力，包埋率反而降低[17]，因此确定最适包埋时间为120 min。

图5 包埋时间对包埋率的影响Fig.5 Effect of embedding time on the embedding rate of CLCEOM

2.3 响应面试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验原理，以包埋率为响应值，壁材添加量(A)、包埋温度(B)、壁芯比(C)为影响因素，设计三因素三水平的响应面优化试验，因素与水平见表1，设计方案及结果见表2。

表1 因素与水平Table 1 Factors and levels

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of the response surface experiment

对表2的数据进行拟合分析，得到二次多项回归方程模型，回归方程为Y=64.72+1.82A-2.36B+6.45C+1.4AB-2.97AC+1.3BC-2.61A2-1.76B2-6.04C2，模型的方差分析见表3。

表3 响应面二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variable of response surface quadratic model

2.4 验证试验

二次回归方程模型得到CLCEOM的最佳制备条件：壁材添加量9.7%，包埋温度32.4 ℃，壁芯比9.99∶ 1，此时包埋率预测值为66.87%。为了检验结果的可靠性，按照此制备条件进行3次验证试验。结合实际情况选取壁芯比为10∶ 1，此时得到的微胶囊包埋率为67.12%，与预测值相差0.25个百分点，验证值和预测值的差值在可接受范围内，证明此方程模型拟合性良好，可用于预测CLCEOM的制备效果。因此，得到 CLCEOM的最佳制备条件：壁材添加量9.7%，包埋温度32.4 ℃，壁芯比10∶ 1，包埋时间120 min，此时包埋率为67.12%。

2.5 微观结构

β-环糊精和CLCEOM的微观结构如图6所示。β-环糊精是形状、尺寸不规则的晶体颗粒，颗粒大小随机分布；CLCEOM颗粒呈现出形状、尺寸比较均匀的立方体晶体结构，形态结构更小、更规则。通过对比分析，CLCEOM的形状、尺寸与β-环糊精有明显区别，表明β-环糊精-CLCEO包合物的形成不是CLCEO与β-环糊精的简单物理混合[30-31]。

图6 β-环糊精和CLCEOM的扫描电镜图Fig.6 SEM characterizations of β-cyclodextrin and CLCEOM

3 结论

将植物精油制备成微胶囊可以使其缓慢释放，提高稳定性。本研究以β-环糊精为壁材，CLCEO为芯材，采用分子包埋法制备CLCEOM，通过单因素试验和响应面法优化微胶囊制备得到最佳工艺参数：壁材添加量9.70%，壁芯比10∶ 1，包埋温度32.4 ℃，包埋时间120 min，此条件下的微胶囊包埋率为67.12%。方差分析显示响应面模型拟合及预测性良好，并进行了验证试验，实际测量值与预测值的误差较小，得到的工艺参数可用于复合植物精油微胶囊的制备工艺研究。通过扫描电子显微镜观察CLCEOM的微观结构，发现与β-环糊精相比，CLCEOM具有更小、更规则的形态，呈立方晶体结构。下一步将探究CLCEOM在花生仁储藏中的应用，为其在粮食储藏中的应用奠定基础。