粪便硫酸类肝素蛋白多糖2与分泌型卷曲相关蛋白2基因甲基化检测在结直肠癌筛查中的应用价值

张利伟，胡海燕

(1.锦州医科大学，辽宁 锦州 121001；2.齐齐哈尔医学院附属第一医院，黑龙江 齐齐哈尔 161041)

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)属于临床上较为常见的消化系统疾病之一，其发病率在全球范围内所有恶性肿瘤中位居第三，且每年约有130多万新增病例，更有69万人因CRC死亡[1-3]。随着近年来人们生活方式的日益变化及人口老龄化问题的逐渐严重，CRC发病人数逐渐增加，且发病年龄逐渐减小，已受到国内外的广泛关注[4]。由于该病发病早期具有极强的隐匿性，一经确诊便已是中晚期，丧失了手术根治的最佳时机，因此预后较差[5]。早期准确诊断CRC对临床治疗及预后具有极其重要的现实意义。既往临床上主要通过肠镜、粪便隐血试验以及血清肿瘤标志物等进行CRC的诊断，但均有一定的临床局限性[6]。有研究[7-8]表明，粪便中分泌型卷曲相关蛋白2(Secreted frizzled related protein 2，SFRP2)基因甲基化是一种潜在的CRC筛查的非侵入性生物标志物，粪便硫酸类肝素蛋白多糖2(Syndecan-2，SDC2)基因甲基化检测也可作为大肠癌早期筛查的无创诊断方法。鉴于此，本研究分析粪便SDC2联合SFRP2基因甲基化检测在CRC筛查中的应用价值，为临床诊断提供数据支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2021年1月至2021年9月在齐齐哈尔医学院附属第一医院普外科或消化内科接受诊治的CRC患者51例为CRC组，其中男性27例，女性24例；年龄34～78岁，平均(55.23±10.38)岁；近端17例，远端34例；肿瘤直径11～48 mm，平均(31.23±5.32)mm；TNM分期中，Ⅰ-Ⅱ期21例，Ⅲ-Ⅳ期30例；低分化15例，中高分化36例。选取同期进展期腺瘤患者61例为进展期腺瘤组，其中男性34例，女性27例；年龄32～79岁，平均(55.34±10.45)岁。选取同期健康体检者50例为正常对照组，其中男性26例，女性24例；年龄31～78岁，平均(55.21±10.38)岁。三组一般资料比较差异无统计学意义(均P>0.05)。病例纳入标准[9]：所有CRC及进展期腺瘤患者均经病理检查确诊；入组前尚未接受相关治疗；均为成年人。排除标准：合并其他恶性肿瘤者；伴有重要脏器严重病变者；)意识障碍或合并精神疾病者；研究期间因故退出或失访者。入组研究对象均于同意书上签名。医院伦理委员会已批准本研究。

1.2 研究方法 首先采集所有受试者的新鲜粪便2～5 g，分别置于两管之中，一管为干燥采样管，另一管为装有15 ml粪便保存液的采样管，充分混匀。保存于常温条件下，3 d内完成相关处理。遵循QIAamp DNA Stool Mini Kit(批号：51504，德国QIAGEN公司)说明书完成标本DNA提取。随后，根据说明书完成粪便DNA亚硫酸盐转化操作。最后采用实时荧光定量PCR法完成SDC2、SFRP2基因甲基化的检测。反应体系35 μl，组成如下：17.5 μl PCR反应预混试剂，2.5 μl反应液，15 μl重亚硫酸盐转化后DNA。反应液的构成包括探针、引物以及ddH2O。且SDC2、SFRP2及内参基因(GAPDH)分别有相应反应液。CpGenome Universal Methylated DNA(批号：S7821，德国默克公司)和Unmethylated DNA(批号：S7822，德国默克公司)也经亚硫酸化处理，以此作为阳性对照及阴性对照。由Beacon Designer 8完成正、反向引物的设计与合成。

1.3 观察指标 比较三组粪便SDC2及SFRP2基因甲基化情况；分析粪便SDC2及SFRP2基因甲基化与CRC患者临床病理特征的关系；分析粪便SDC2及SFRP2甲基化筛查CRC的效能。

1.4 统计学方法 数据处理工具选择SPSS 22.0统计学软件。计数资料以[例(%)]表示，行χ2检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析粪便SDC2及SFRP2基因甲基化检测筛查CRC的效能。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组粪便SDC2及SFRP2基因甲基化情况比较 见表1。CRC组患者粪便SDC2及SFRP2基因甲基化率高于进展期腺瘤组和正常对照组，且进展期腺瘤组粪便SDC2及SFRP2基因甲基化率高于正常对照组(均P<0.05)。

表1 三组粪便SDC2及SFRP2基因甲基化情况比较[例(%)]

2.2 粪便SDC2基因甲基化与CRC患者临床病理特征的关系 见表2。TNM分期Ⅲ-Ⅳ期CRC患者粪便SDC2及SFRP2基因甲基化率高于Ⅰ-Ⅱ期患者(均P<0.05)。而性别、年龄、病变部位、肿瘤大小以及分化程度均与CRC患者粪便SDC2及SFRP2基因甲基化无相关性(均P>0.05)。

表2 粪便SDC2基因甲基化与CRC患者临床病理特征的关系[例(%)]

2.3 粪便SDC2及SFRP2基因甲基化检测筛查CRC的效能 见表3。ROC曲线分析显示，粪便SDC2及SFRP2基因甲基化单项检测筛查CRC的效能较高，且两者联合检测的效能高于单项检测。

表3 粪便SDC2及SFRP2基因甲基化检测筛查CRC的效能

3 讨 论

迄今为止，关于CRC的具体病因及发病机制尚存在一定争议，目前普遍认为可能和遗传、生活方式以及精神压力等因素有关[10-12]。因其发病早期无特异性症状，绝大多数患者一经确诊便已是中晚期，临床治疗效果较差，预后不良[13-14]。由此可见，加强对人群CRC的筛查，提高早期肿瘤的检出率，显得尤为重要，亦是降低CRC发病率及改善预后的重中之重。结肠镜检查是得到广泛认可的筛查CRC金标准，但其属于有创检查，且在检查前需要较为复杂的肠道准备，加之检查过程中会对患者造成不同程度的痛苦，具有一定的出血或(和)穿孔风险，从而导致患者检查依从性较低[15-16]。而粪便DNA检测是近年来所发展起来的一种早期筛查手段，其主要通过采集粪便中脱落细胞DNA，继而明确CRC过程中的基因变化，具有无创性、无需肠道准备等优势[17-18]。

本研究结果发现，CRC组患者粪便SDC2及SFRP2基因甲基化率均高于良性进展期腺瘤组和正常对照组，且进展期腺瘤组粪便SDC2及SFRP2基因甲基化率均高于正常对照组，这提示了CRC及进展期腺瘤中存在异常的SDC2和SFRP2基因甲基化。究其原因，SDC2基因参与了细胞分裂、迁移等过程，且有研究[19]证实肿瘤组织内的SDC2目标区域甲基化水平明显高于成对相邻非肿瘤组织中的SDC2目标区域，因此该基因甲基化异常可成为CRC早期检测的肿瘤标志物之一。SFRP2基因定位于染色体4q31.3上，含有2个内含子及3个外显子，且第1外显子周围分布高密度CpG岛，和肿瘤细胞DNA甲基化息息相关，是Wnt信号通路的信号拮抗因子，而Wnt信号通路又在肿瘤发生、发展过程中起着至关重要的作用。另外，本研究结果还显示了TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期CRC患者粪便SDC2、SFRP2基因甲基化率高于Ⅰ-Ⅱ期患者，这反映了粪便SDC2、SFRP2基因甲基化和CRC患者临床分期密切相关，即随着上述基因甲基化的发生，CRC患者病情加剧，两者具有作为评估CRC患者病情严重程度的潜在价值。分析其原因，可能是上述两项基因甲基化频繁发生于CRC中，在肿瘤的分化、繁殖过程中起着至关重要的作用。然而，多项研究[20-22]发现，粪便基因SDC2基因甲基化和CRC患者TNM分期无关，本研究结果与其不一致，其原因可能与研究样本量、基因组DNA来源不同有关。此外，经ROC曲线分析发现，粪便SDC2及SFRP2基因甲基化单项检测筛查CRC的效能较高，且两者联合检测的效能高于单项检测，与柏愚等[23]研究结果一致。究其原因，双基因联合检测可覆盖多种肿瘤形成的分子途径，进一步为临床诊断提供更为全面、可靠的数据，继而达到提高检测灵敏度及特异度的目的。

综上所述，粪便SDC2及SFRP2基因甲基化检测有助于筛查CRC，具有较高的临床推广应用价值。