微小RNA-195通过靶向BIRC5调控肝癌Hep3B细胞凋亡实验研究

李玉龙，宗 伟，常素娥，陈思攀

(1.陕西省人民医院消化内科，陕西 西安 710068；2.西安交通大学第二附属医院骨科，陕西 西安 710004；3.陕西省人民医院介入放射科，陕西 西安 710068)

肝细胞癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，其发病呈增长趋势[1-2]。肝癌的发生是一个复杂、多阶段、涉及多因素的过程，包含原癌基因激活、抑癌基因失活、信号通路异常、肿瘤微环境改变、肿瘤细胞发生代谢重编程、表观遗传异常、免疫系统失调等。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)作为表观遗传学中的重要分子，引起了人们的广泛关注。miRNA是一类内源性长度约22 nt的调节基因表达的非编码RNA。肝癌中存在多种miRNA的异常表达，通过调控不同靶基因参与肿瘤增殖、迁移、侵袭、凋亡等过程[3]。miRNA可以作为预测肝癌的生物标志物，如miR-221[4]、miR-182[5]、 miR-375和miR-199a-3p[6]等。

miR-195位于17号染色体，在多种肿瘤中发挥抑癌基因作用，在肝癌组织及细胞系中的表达水平低于正常对照[7]。miR-195能够靶向调控多种靶基因，如YAP[8]、AEG-1[9]、LATS2[10]等，发挥抑癌基因作用。在本研究中，我们将探讨miR-195对人肝癌Hep3B细胞增殖及凋亡的影响及其可能涉及的分子机制，以期为肝癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人肝癌Hep3B细胞、HEK293细胞购自中国科学院细胞库。Lipofectamine 2000 购自 Invitrogen公司，凋亡试剂盒购自上海七海复泰生物科技有限公司。小干扰RNA(siRNA)由上海吉玛制药技术有限公司合成，其中si-ctrl-S序列为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；si-ctrl-A序列为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；si-BIRC5-S序列为5’-GAAGAAAGAAUUUGAGGAATT-3’；si-BIRC5-A序列为5’-UUCCUCAAAUUCUUUCUUCTT-3’。报告基因由北京擎科生物科技有限公司合成，其中BIRC5 WT-S序列为5’-CTGCCTGTGCAGCGGGTGCTGCTGC-3’；BIRC5 WT-A序列为5’-TCGAGCAGCAGCACCCGCTGCACAGGCAGAGCT-3’；BIRC5 MT-S序列为5’-CTGCCTGTGCAGCGGGTGCACGAGC-3’；BIRC5 MT-A序列为5’-TCGAGCTCGTGCACCCGCTGCACAGGCAGAGCT-3’。

1.2 细胞培养 人肝癌Hep3B细胞及人胚胎肾细胞HEK293用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，放于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中进行培养。

1.3 细胞转染 将Hep3B细胞铺入培养板，24 h后应用Lipofectamine 2000 分别转染 miR-195、miR-ctrl、si-BIRC5及si-ctrl至Hep3B细胞，依次标记为miR-195组、miR-ctrl组、si-BIRC5组和si-ctrl组。

1.4 MTT实验 将Hep3B细胞铺入 96 孔培养板，按上述分组进行转染。转染后 24、48、72 h分别加入MTT，于37 ℃培养箱放置 4 h，取出后弃去液体加入150 ml DMSO溶解，用酶标仪测定 吸光度(OD)值。

1.5 细胞凋亡实验 将Hep3B细胞计数铺板，24 h后按照分组处理细胞。转染24 h后，胰酶消化细胞，收集于15 ml离心管中，离心后弃上清，PBS冲洗细胞2～3次。弃去PBS，重新加入Binding Buffer重悬细胞，用FITC/PI双染细胞，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.6 双荧光报告基因实验 生物信息软件分析发现miR-195与BIRC5 3’-UTR区存在可能的结合位点，根据结合位点设计并合成BIRC5 3’-UTR(正常与突变)序列，构建pmirGLO-BIRC5(WT/MT)载体。实验分为四组：无处理细胞组(对照组)，miR-195与pmirGLO空载体共转染组，miR-195与pmirGLO-BIRC5-WT共转染组(BIRC5-WT组)，以及miR-195与pmirGLO-BIRC5-MT共转染组(BIRC5-MT组)。将HEK 293细胞接种于96孔板中，按上述分组进行转染，24 h后进行荧光素报告实验，检测各处理组荧光素酶表达情况。

1.7 生物信息学分析 应用SangerBox数据分析平台(http://sangerbox.com/)分析BIRC5在多种肿瘤中的表达，应用LinkedOmics[11]分析miR-195与BIRC5在肝细胞癌中的相关性。

1.8 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-195对肝癌Hep3B细胞增殖及凋亡的影响 见图1。MTT实验发现，与miR-ctrl组相比，miR-195组Hep3B细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。细胞凋亡实验发现，Hep3B细胞过表达miR-195后细胞凋亡比例显著高于对照组(P<0.05)，表明miR-195可促进Hep3B细胞凋亡。

注：与miR-ctrl组比较，*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

2.2 miR-195靶基因分析 见图2。应用Linked Omics网站分析发现，miR-195与BIRC5在肝细胞癌中呈负相关(P<0.05)。进一步通过双荧光素酶报告基因实验检测二者靶向关系，结果发现miR-195和pmirGLO-BIRC5-WT共转染后与对照组相比荧光活性显著降低，而miR-195与pmirGLO-BIRC5-MT共转染组与对照组荧光活性比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明miR-195可靶向作用BIRC5。

左图为miR-195与BIRC5相关性分析；右图为双荧光素酶报告基因实验结果，与对照组比较，#P<0.05

2.3 生物信息分析BIRC5在多种肿瘤中的表达情况 见图3。生物信息学网站SangerBox分析基于TCGA和GTEx数据库中BIRC5在包含LIHC在内的多种肿瘤的表达，发现BIRC5在包括肝细胞癌在内的多种肿瘤中显著高表达(均P<0.05)。

注：与对照组比较，*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

2.4 沉默BIRC5对Hep3B细胞增殖及凋亡的影响 见图4。MTT实验发现，与si-ctrl组相比，si-BIRC5组细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。细胞凋亡实验发现，si-BIRC5组细胞凋亡比例显著高于si-ctrl组(P<0.05)，表明沉默BIRC5可促进Hep3B细胞凋亡。

注：与si-ctrl组比较，*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

3 讨 论

目前手术是肝癌根治性治疗的主要手段。肝癌早期症状不明显，晚期肝癌患者伴有明显疼痛感，严重影响患者的生活质量[12]，故多数患者确诊时已处于中晚期，基本丧失手术治疗的机会。尽管仍有多种治疗方式如放疗、化疗、局部消融治疗等可供选择，但现有治疗方法疗效有限，复发率高，易发生远处转移，预后较差。近年来，分子靶向治疗已成为研究的热点，引起人们的广泛关注，靶向药物索拉卡菲尼、瑞格非尼、仑伐替尼等已进入临床应用。靶向药物与化疗药物联合使用可能会改善患者预后。有研究[13]发现索拉非尼联合联合卡培他滨与单独使用索拉菲尼相比可改善肝细胞癌患者预后。寻找合适的分子靶标对肝癌靶向治疗有重要意义。

我们通过应用LinkedOmics网站分析miR-195与BIRC5在肝细胞癌中表达的相关性，发现两者呈显著负相关，双荧光素酶报告基因实验检测二者靶向关系，结果表明miR-195可靶向作用BIRC5。BIRC5(Survivin)是一种控制细胞分裂、抑制细胞凋亡的蛋白质[14]。它是凋亡抑制蛋白(IAP)家族成员之一，该家族成员结构较相似，都具有杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列(BIR)结构域，该结构可能是半胱天冬酶(Caspase)的结合区域，为IAP 发挥抑制凋亡作用所必需[15]。BIRC5(Survivin)位于17号染色体长臂上，存在一个不含TATA盒的启动子，启动子含有3个细胞周期依赖性元件(CDE)和1个细胞周期同源结构域(CHR)[16]。BIRC5在成人终末分化组织中一般不表达或呈低表达，但在包括乳腺癌、肺癌、宫颈癌等多种肿瘤中广泛表达[17-19]。BIRC5能够抑制Caspase-3活性，从而调控细胞凋亡[20]。BIRC5在肿瘤中高度表达，在细胞分裂和细胞凋亡抑制过程中同时发挥作用，与肿瘤分级、预后不良等相关[21]。已有研究[22]表明BIRC5高表达与肝癌预后不良相关。肿瘤是一类异质性疾病，与细胞异常增殖及细胞死亡调控异常密切相关。参与细胞凋亡调控的分子被认为是肿瘤治疗的潜在靶标，而BIRC5作为IAP家族成员，在细胞周期进程和凋亡抑制中发挥重要作用，其作为肿瘤治疗的靶标引起人们的广泛关注。

基于TCGA及GTEx数据库，我们通过SangerBox数据分析平台分析BIRC5在包括肝癌在内的27种肿瘤的表达水平，发现BIRC5在包括肝癌在内的多种肿瘤中呈高表达，提示BIRC5可能在肿瘤中发挥重要的癌基因作用。我们应用RNA干扰技术沉默BIRC5的表达后发现，沉默其表达可抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡，提示BIRC5在肝癌发生、发展过程中发挥癌基因的作用。

综上所述，miR-195可通过靶向调控BIRC5抑制肝癌Hep3B细胞增殖，促进其凋亡。BIRC5可作为肝细胞癌靶向治疗的新靶标。在后续研究中，我们将通过挽救实验、Western blot实验、体内实验等进一步探索miR-195/BIRC5轴在肝癌进展中的作用。