Core 3 O-型糖链参与大肠杆菌对肠上皮细胞黏附和侵袭的影响

刘 韵 叶 钧

1.陆军军医大学第一附属医院消化内科，重庆 400038；2.陆军第九五八医院消化科，重庆 400020

黏蛋白O-型糖链根据在丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）分子上不同连接，可分为Core 1～8八种不同O-型糖链[1]。不同类型的O-型糖链由不同的糖基转移酶催化合成，Core 3 O-型糖链由β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶6（β3gnT6）催化合成。肠致病性大肠杆菌（EPEC）和肠出血性大肠杆菌（EHEC O157∶H7）可引起患者从轻度腹泻到严重疾病的发生，如出血性肠炎[2]；O-型糖链可能与肠道共生菌群的选择相关，同时可以作为不同细菌的黏附位点[3]。本课题组前期研究发现，苯甲基-α-N-乙酰半乳糖胺（benzyl-α-GalNAc）抑制肠上皮细胞O-型糖链的合成，将导致细菌黏附于肠上皮细胞细菌数减少，同时侵袭入细胞内细菌数增加。因benzyl-α-GalNA抑制的是肠上皮细胞所有O-型糖链的合成，不能鉴别出是哪种O-型糖链在细菌的黏附和侵袭过程中发挥作用，本研究通过构建Core 3 O-型糖链过表达结肠上皮细胞株来探讨Core 3 O-型糖链对细菌黏附和侵袭肠上皮细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

人类结肠癌细胞系HT-29（T25-flask，货号CBP60011）和LS174T（T25-flask，货号CBP60033）购买于上海中科院细胞库。EPEC、EHEC O157∶H7、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）来自陆军军医大学微生物教研室。β3gnT6过表达慢病毒（1 ml，滴度为108，货号L2016-745SH）由上海吉玛公司合成，庆大霉素注射液购买于西南药业有限公司（2 ml∶80 000单位，国药准字H50021451），TEER测定细胞培养板（12孔，货号3422）购买于美国Costar公司，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）染色液（1 ml，货号S7109）购买于美国Sigma公司，McCoy’s 5A培养基（500 ml，货号M9309）购买于美国Sigma公司，Triton X-100（100 ml，货号T8200）购买于北京索莱宝公司。

1.2 β3gnT6过表达细胞系建立和鉴定

Ctr/HT-29、β3gnT6/HT-29、Ctr/LS174T、β3gnT6/LS174T细胞株的建立和鉴定具体方法参照本课题组前期文献[4]。

1.3 细菌黏附试验（克隆计数法）

当Ctr/HT-29、β3gnT6/HT-29、Ctr/LS174T和β3gnT6/LS174T细胞株生长融合至80%时，制备成细胞悬液，并接种于24孔板。待其生长融合至单层细胞时，加入PBS清洗3次，再加入无血清McCoy’s 5A培养基培养2 h，使细胞株适应无血清状态，再向每个培养孔中加入相同浓度的EPEC或EHEC O157∶H7，37℃细胞培养箱中共孵育2 h。将培养板取出，倒掉培养基，用冷PBS清洗3次，抑制细菌进一步生长和去除未黏附的细菌，再通过细胞刮将黏附于细胞株表面的细菌刮下，再按照梯度稀释的方法将其均匀涂布在MacConkey琼脂板上，37℃细菌培养箱中过夜，最后用菌落计数法计数黏附于细胞表面的细菌数。

1.4 细菌黏附试验（直接观察法）

细菌与细胞共培养方法同上，去除未黏附细菌后，向培养孔中加入碘化丙啶（PI）室温染色细菌30 min，再用PBS清洗3次，最后用荧光显微镜观察和计数黏附于细胞表面的细菌数。

1.5 细菌侵袭试验

当Ctr/HT-29、β3gnT6/HT-29、Ctr/LS174T和β3gnT6/LS174T细胞株生长融合至80%时，制备成细胞悬液，并接种于24孔板中。待其生长融合至单层细胞时，加入PBS清洗3次，再加入无血清McCoy’s 5A培养基培养2 h，使细胞株适应无血清状态，再向每个培养孔中加入相同浓度的EIEC，37℃细胞培养箱中共孵育2 h，将培养板取出，倒掉培养基，用冷PBS清洗3次，再向培养孔中加入100 μg/ml庆大霉素，37℃细胞培养箱中共孵育2 h，以杀灭黏附于细胞表面的细菌，再用PBS清洗3次。然后向每孔中加入200 μl 0.25%的胰蛋白酶和0.025% Triton X-100，37℃细胞培养箱中孵育10 min，以破裂细胞和使细胞内的细菌释放出来，再将裂解液均匀涂布在MacConkey琼脂板上，37℃细菌培养箱中过夜，最后用菌落计数法计数侵袭入细胞内的细菌数。

1.6 TEER测定

当Ctr/HT-29、β3gnT6/HT-29、Ctr/LS174T和β3gnT6/LS174T细胞株生长融合至80%时，制备成细胞悬液，并将其接种于TEER测定细胞培养板中，当细胞株生长融合至单层细胞时，加入PBS清洗3次，再加入无血清McCoy’s 5A培养基培养2 h，再向培养孔中加入相同浓度的EPEC或EHEC O157∶H7，在不同时间点（0、3、6、12、24 h）测定其TEER值。

1.7 统计学方法

使用SPSS 22.0统计学软件分析数据，采用样本t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细菌黏附实验（克隆计数法）结果

黏附于β3gnT6/HT-29细胞株表面的EPEC和EHEC O157∶H7细菌数明显少于Ctr/HT-29细胞株（P＜ 0.01）；黏附于β3gnT6/LS174T细胞株表面的EPEC和EHEC O157∶H7细菌数明显少于Ctr/LS174T细胞株（P＜ 0.01）。见图1。

图1 黏附于细胞表面的EPEC和EHEC O157∶H7（＊＊P ＜ 0.01）

2.2 细菌黏附实验（直接观察法）结果

采用荧光显微镜观察发现，黏附于β3gnT6/HT-29细胞株表面的EPEC和EHEC O157∶H7细菌数明显少于Ctr/HT-29细 胞 株（P＜ 0.01）；黏附于β3gnT6/LS174T细胞株表面的EPEC和EHEC O157∶H7细菌数少于Ctr/LS174T细胞株（P＜ 0.01或P＜ 0.05）。见图2。

图2 荧光显微镜观察黏附于细胞表面的EPEC和EHEC O157∶H7（＊P ＜ 0.05；＊＊P ＜ 0.01）

2.3 细菌侵袭实验结果

侵袭入β3gnT6/HT-29细胞株内的EIEC细菌数多于Ctr/HT-29细胞株（P＜ 0.05）；侵袭入β3gnT6/LS174T细胞株内的EIEC细菌数明显多于Ctr/LS174T细胞株（P＜ 0.01）。见图3。

图3 侵袭入细胞内的EIEC细菌数（＊P ＜ 0.05；＊＊P ＜ 0.01）

2.4 TEER实验结果

在不同时间点（0、3、6、12、24 h）检测细胞株TEER值发现，未在EPEC或EHEC O157∶H7感染下，β3gnT6过表达细胞株TEER值的变化与其对照细胞比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。在EPEC或EHEC O157∶H7感染下，β3gnT6过表达细胞株TEER值下降较其对照细胞更明显，差异有统计学意义（P＜ 0.01或P＜ 0.05）。见图4。

图4 不同时间点细胞株TEER值变化

3 讨论

在发展中国家，引起婴幼儿腹泻的主要致病菌是EPEC和EHEC O157∶H7[5]，尽管对于EPEC或EHEC O157∶H7感染患者有一些有效的治疗手段，但为进一步优化治疗策略，需要明确EPEC或EHEC O157∶H7在肠道多重防御屏障保护下是如何致病的。在人体肠道中，EPEC或EHEC O157∶H7致病的第一步是黏附于肠道黏液屏障中的糖链上，进而定植和感染肠道上皮细胞。另一重要步骤是细菌通过Ⅲ型分泌系统分泌相关效应蛋白，使细菌进一步侵袭入肠道黏液层，进而引起肠道炎症的发生[6]。

肠道黏液屏障作为人体阻挡外界病原体、毒素的防御屏障，在人体生命活动中起至关重要的作用。结肠黏液屏障分为两层，最外面的一层为疏松层，含大量细菌；最里面一层为致密层，无细菌定植[7-8]。黏液屏障主要由肠道杯状细胞分泌的MUC2和IgGFcγBP及穿插在肠上皮细胞的膜相关黏蛋白（如MUC1、MUC3、MUC4）组成。分泌型黏蛋白和膜相关型黏蛋白有一个共同特点，就是在其内部含大量的串联重复序列（VNTRS），该重复序列中含大量的O-型糖链和N-型糖链的修饰位点。黏蛋白分子质量大约80%由O-型糖链组成，因此黏蛋白分子的功能与O-型糖链密切相关[9-12]。同时有研究表明，肠道黏蛋白O-型糖链参与细菌与宿主相互作用过程[13-18]，在哺乳动物中，敲除Core 1或Core 3 O-型糖链将导致自发性结肠炎的发生[19]。

本课题组前期研究发现，通过benzyl-α-GalNAc抑制HT-29和HT-29-Gal细胞O-型糖链的合成，将导致EPEC和EHEC O157∶H7黏附肠上皮细胞数量减少，同时抑制肠上皮细胞MUC2分泌[20-21]，因O-型糖链根据不同的连接在Ser/Thr残基上，黏蛋白O-型糖链可区分为八种核心结构（Core1~8）[22-23]，benzyl-α-GalNAc抑制的是肠上皮细胞所有O-型糖链的合成，不能区分是哪一种或哪几种O-型糖链参与细菌黏附和侵袭。因此本课题组进一步研究发现，抑制肠上皮细胞Core 2 O-型糖链的合成，将导致EPEC和EHEC O157∶H7黏附肠上皮细胞数量减少[24]，这提示Core 2 O-型糖链参与EPEC和EHEC O157∶H7黏附肠上皮细胞。本研究通过促进肠上皮细胞Core 3 O-型糖链的合成，进而明确Core 3 O-型糖链是否参与细菌黏附和侵袭肠上皮细胞。本研究显示，促进肠上皮细胞Core 3 O-型糖链的合成将抑制EPEC和EHEC O157∶H7黏附肠上皮细胞，同时增加EIEC侵袭入肠上皮细胞。这提示Core 3 O-型糖链可能不是EPEC和EHEC O157∶H7的黏附位点，Core 3 O-型糖链合成增加，将阻遏细菌黏附肠上皮细胞。同时Core 3 O-型糖链合成增强，导致EIEC侵袭入肠上皮细胞内细菌数增加，这可能是Core 3 O-型糖链的合成破坏了细胞屏障功能。因此，本研究测定不同时间点β3gnT6过表达细胞株与对照细胞株的TEER值，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。而在EPEC或EHEC O157∶H7感染下，β3gnT6过表达细胞株的TEER值与其对照细胞比较明显下降（P＜ 0.01或P＜ 0.05），提示增加Core 3 O-型糖链的合成将导致细胞屏障的通透性增加，Core 3 O-型糖链具有调节细胞黏膜屏障的作用。同时有文献研究表明，在小鼠中，敲除C1galt1（合成Core 1 O-型糖链酶）将改变肠道通透性，进而增加肠道炎症及肿瘤的发生[25]，而Core 1 O-型糖链与Core 3 O-型糖链的合成共用同一底物，抑制Core 1 O-型糖链的合成将增加Core 3 O-型糖链的合成[22-23]，该体外研究结果与其一致。细胞株TEER值的差异发生在细菌感染条件下，而不是非感染条件下，这种差异的发生有待后续进一步探究其机制。

总之，本研究结果提示Core 3 O-型糖链参与EPEC和EHEC O157∶H7黏附肠上皮细胞，同时Core 3 O-型糖链参与EIEC侵袭肠上皮细胞，或许为将来肠道感染疾病的治疗提供新的靶点。