高压氧对去卵巢大鼠骨微结构改善及骨代谢的影响机制探究

白登彦 王 冠 张海军 朱 涛 赵志鹏

1.甘肃省第二人民医院骨科，甘肃兰州 730000；2.西北民族大学附属医院骨科，甘肃兰州 730000

骨质疏松症（osteoporosis，OP）在临床上大多是由于骨量减少和骨微结构改变有关，世界卫生组织（WTO）将OP定义为骨微机构损伤，骨量持续减少导致骨脆性变高的临床骨病。美国国立卫生研究院（NIH）提出OP是骨强度降低引发的高风险性的骨骼临床疾病。OP在一定程度上能够减少骨载荷承受力、骨脆性增加，增加骨折发病风险和各种慢性的疼痛[1]。在免疫系统、神经内分泌系统等多组织和器官的协作下，导致OP的发生。临床诊断中，骨量减少、骨代谢标志物减少都是诊断OP的标准。研究表明[2]，高压氧疗可能对骨微结构改善及成骨细胞生成有一定促进作用，但具体机制仍不明确。本次实验通过研究去卵巢大鼠OP模型，在高压氧的干预措施下，旨在探究高压氧对去卵巢大鼠骨代谢平衡的影响机制。

1 资料与方法

1.1 动物

选取30只SPF级Wistar雌性大鼠[购自甘肃中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK（甘）2020-0001]，体重（170±20）g，同等条件下喂养1周后进行OP造模。本实验经本院动物实验伦理委员会批准通过。

1.2 药品及试剂

BALP ELISAKit（批号：E201902）、CBF-α1 ELISAKit（批号：E201906）、E2 ELISAKit（批号：E201908）、CTX-I ELISAKit（批号：E201906）、PINP ELISAKit（批号：E201905）、OC ELISAKit（批号：E201901） ，北京方程生物有限公司生产。

1.3 仪器

微型实验动物CT影像系统（西门子，德国）；骨密度仪（韩国，型号： EXA-PRESTO） ；酶联免疫检测仪（BIO-RAD，美国）；高压氧舱（上海七零一所）。

1.4 动物分组与造模

将30只大鼠随机分成空白组、模型组、高压氧组，每组大鼠各10只。空白组不进行任何干预，其他两组大鼠通过去卵巢法建立骨质疏松模型大鼠[3]。造模成功后，高压氧组大鼠每天进行高压氧疗30 min，舱压固定为0.25 MPa，吸纯氧。三组大鼠其余饲养条件等相同，持续干预4周。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 骨代谢标志物BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PⅠNP、OC、E2含量测定大鼠处死后心脏取血2 ml，设置离心R为10 cm，转速3000 r/min，离心10 min，取上清液，ELISA法检测血清中雌二醇E2、核结合因子-α1（core binding factor-α1，CBF-α1）、骨特异性碱性磷酸酶（Bone specific alkaline phosphatase，BALP）、Ⅰ型 胶 原 羧 基 末 端 肽（Cterminal type Ⅰcollagen telopeptide，CTX-Ⅰ）、Ⅰ型前胶原氨基端前肽（procollagen typeⅠamino-terminal peptide，PⅠNP）、骨钙素（osteocalcin，OC）含量水平。

1.5.2 骨微结构及骨密度测定大鼠腹主动脉取血，分离大鼠右侧股骨，对股骨干骺端进行CT扫描，CT参数设定为：65 kV，384 mA，分辨率18 μm。扫描完成后三维重组感兴趣区域（region of interest，ROI），提取骨微结构重建图，骨骼分析软件Advanced Bone Analysis（ABA）对骨微结构参数包括相对骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、连接密度（Conn.D）、骨结构模型指数（SMI）及骨密度（BMD）进行计量学分析。

1.6 统计学方法

应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，所有计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（oneway- ANOVA），两组间比较采用χ2检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠骨密度及骨代谢标志物比较

与空白组比较，大鼠造模成功后模型组BMD及BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PⅠNP、OC、E2含量显著降低（P＜ 0.05）；高压氧干预4周后，与模型组对比，高压氧组大鼠BMD、BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PⅠNP、OC、E2含量不同程度升高（P＜ 0.05）。见表1。

表1 各组大鼠BMD及骨代谢标志物含量比较（±s）

表1 各组大鼠BMD及骨代谢标志物含量比较（±s）

注 与空白组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，△P ＜ 0.05；BMD：骨密度，BALP：骨特异性碱性磷酸酶，CBF-α1：核结合因子-α1，CTX-Ⅰ：Ⅰ型胶原羧基末端肽，PⅠNP：Ⅰ型前胶原氨基端前肽，OC：骨钙素，E2：雌二醇

2.2 各组大鼠骨小梁微结构比较

与空白组比较，造模后模型组大鼠骨相对骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、连接密度（Conn.D）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、结构模型指数（SMI）均出现不同程度改变（P＜ 0.05）；高压氧干预4周后，与模型组对比，高压氧组大鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D、Tb.Sp、SMI参数发生不同程度改变（P＜ 0.05），骨强度及弹性显著增加。见表2。

表2 各组大鼠骨小梁微结构参数比较（±s）

表2 各组大鼠骨小梁微结构参数比较（±s）

注 与空白组比较，*P ＜ 0.05，与模型组比较，△P ＜ 0.05，BV/TV：相对骨体积分数、Tb.N：骨小梁数量、Tb.Th：骨小梁厚度、Tb.Sp：骨小梁分离度、Conn.D：连接密度、SMI：骨结构模型指数

组别 n BV/TV（%） Tb.N（cm-1） Tb.Th（μm） Conn.D（cm-3） Tb.Sp（cm-1） SMI空白组 10 1.341±0.01 10.321±0.51 60.042±9.82 125.032±9.26 1.643±0.01 1.601±0.03模型组 10 1.062±0.03* 5.420±0.07* 33.870±9.01* 79.156±9.37* 3.061±0.32* 3.520±0.02*高压氧组 10 1.203±0.05△ 8.731±0.32△ 41.390±10.37△ 98.311±10.84△ 1.980±0.02△ 2.713±0.12△F值 17.642 16.155 10.862 12.317 13.161 10.552 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

导致OP的成因与很多学说相关，微循环障碍、代谢异常、基因多态性等因素密切相关[4-5]。伴随经济社会发展，老龄化趋势随人口数量激增越来越明显，这也导致OP的发病率增加，由其导致的骨折风险也越来越高。

高 压 氧 疗（hyper bari coxygen therapy，HBO）是一种辅助治疗方法，通过高压氧的环境实现治疗的作用。有学者发现[6-7]，在高压氧环境中，氧分子的间距增加，此时可以极大提高血氧张力，加速新生小血管和侧支循环进行，维持人体生命活动。而且研究还证实[8-9]，HBO可加速组织内骨痂胶原蛋白生成速度及骨痂钙盐沉积。PⅠNP是骨形成初期的敏感指标之一，CTX-Ⅰ作为骨吸收状态下Ⅰ型胶原释放的主要因子，其表达高低决定Ⅰ型胶原含量多少，CTX-Ⅰ的表达能够体现成骨细胞的活性和骨吸收的情况，是诊断骨质疏松症的金指标[10-11]。CBF-α1是影响成骨细胞分化的重要因子，CBF-α1能够促进成骨细胞进行表达，人体骨骼才能得以正常生长，维持骨骼正常发育。CBF-α1还能够调控双向调节成骨细胞的分裂分化过程，加速未分化成骨细胞的表达及已分化成骨细胞的活性[12]。通常情况下，成骨细胞会分泌OC，OC的表达高低能直接反映成骨细胞的活性和功能变化[13]。骨代谢的平衡情况都可以通过CTX-Ⅰ、NTX-1、CBF-α1以及OC表达来体现。BALP是由下丘脑分泌一种活性因子，通过介导破骨细胞，影响骨吸收，是骨吸收的标志物之一。有文献表明[14-15]，BALP通过诱导成骨细胞的形成，加速骨吸收，从而使骨密度增加，提高骨强度，加速骨吸收的速度；同时，OP的发生与发展，也与骨密度和骨小梁微结构的变化密切相关。

本实验证实，大鼠摘除卵巢后，其BMD显著降低，骨小梁微结构损伤不完整，证明OP模型成功建立。与空白组相比，OP大鼠血清中骨代谢相关标记物BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PⅠNP、OC、E2含量显著变化，BMD明显降低，骨小梁显微结构不完整，提示OP大鼠骨量减少，骨吸收能力增多，骨形成减少，符合临床中OP的临床表现。与模型组相比，经过高压氧的干预治疗，OP大鼠骨密度明显增加，骨小梁微结构发生明显改善，骨量流失减缓。这与权学莲等[16]的研究结果相类似。但在本研究中，高压氧治疗延缓骨质疏松的作用机制尚不明确，有待在接下来的实验中探究。

综上所述，高压氧可减轻大鼠骨量减少骨密度的降低，加速骨质疏松后骨质的矿化和骨的生成，并能改善骨微结构。这也提示，高压氧治疗可能成为绝经后骨质疏松症患者的辅助治疗方案，但具体机制仍有待研究。