冬枣核总黄酮提取工艺响应曲面法的优化

杨文义 李倩倩 李 倩 位建威 于 燕 曲桂武 吕长俊 刘德胜

滨州医学院 山东 烟台 264003

冬枣是产自山东省滨州市的中国国家地理标志产品，2018年滨州冬枣成为中国品牌价值评价信息发布的“全国地标产品100强”，是滨州市大力打造的农业品牌之一。冬枣营养丰富，富含多种矿物质、多种维生素、多糖、黄酮以及其他生物活性物质[1-3]。目前，除鲜食外，产业界已经开发了多元化冬枣相关产品，包括冬枣浓缩汁、冬枣酒、冬枣粉、冻干冬枣、冬枣酱以及脆冬枣等。对其加工剩余冬枣核的相关研究并不多。本研究以滨州冬枣加工后剩余的枣核为研究对象，采用响应曲面法对超声辅助提取冬枣核总黄酮类化合物进行了工艺优化，以便进一步开发利用冬枣，并实现冬枣价值最大化，提升品牌价值，增加农民收入。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 本研究采用的冬枣核产自滨州市沾化区下洼镇。酸枣核于2020年10月采自昆嵛山，经我校中药学教研室鉴定为鼠李科枣属植物酸枣的果核。亚硝酸钠、九水硝酸铝、NaOH、无水乙醇均为分析纯。芦丁(西安天宝生物科技有限公司，纯度>98%，批号为TB201160221)。

1.2 仪器 紫外-可见分光光度计(TU-190型，北京普析通用仪器有限公司)，超声波清洗器(DL-120B，北京中仪友信有限公司)，循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ，郑州长城工贸有限公司)，旋转蒸发仪(N-1200B，日本东京理化仪器有限公司)。

1.3 提取方法

1.3.1 冬枣核的处理 冬枣去果肉，水浸泡，洗净，烘干，然后粉碎，过100目筛，精称约1 g后加入溶剂后超声提取，过滤后减压挥干溶剂，得到冬枣核粗提物。

1.3.2 标准曲线的绘制 按照参考文献[4]所述方法，以芦丁为标准品，精密称取芦丁标准品2 mg，用60%的乙醇溶液溶解，并定容在10 mL容量瓶，以此为母液，制备不同浓度标准溶液。分别吸取不同浓度标准溶液4～10 mL滴入容量瓶中，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀，静置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸铝，混匀，静置6 min，再加入4 mL 4%NaOH溶液，加入60%乙醇定容至10 mL ，静置20 min，在510 nm处测量其吸光度，以吸光度为纵坐标和标准溶液浓度为横坐标作标准曲线。

1.3.3 冬枣核总黄酮提取工艺条件

1.3.3.1 单因素实验设计 考察提取温度、提取时间、乙醇体积分数、超声功率为单因素，考察上述因素对冬枣核总黄酮提取率的影响。

1.3.3.2 响应曲面实验设计[5]以冬枣核总黄酮提取率为响应面值，选择上述4个单因素，再运用Design-Expert软件设计本研究所探究的工艺参数(表1)。

表1 冬枣核总黄酮提取的响应曲面分析因素水平

1.3.3.3 冬枣核总黄酮的含量测定 取1.3.1项下所得冬枣核提取物，用60%乙醇溶解，并定容到25 mL容量瓶，取4～10 mL滴入容量瓶中，依照1.3.2项从“加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液”做起，在510 nm处测定吸光度。

2 结果

2.1 标准曲线 芦丁对照品溶液在实验设计浓度范围内与吸光度成良好线性关系。线性回归方程为A=0.004 7C-0.0039 2，线性相关系数为r=0.998 5，标准曲线的线性范围为13.0～208.0 μg/mL。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 乙醇体积分数对冬枣核总黄酮提取率的影响 精称冬枣核粉约1 g，共3份，分别置于250 mL烧杯中，分别加入50 mL 50%乙醇，料液比为1∶50，设置提取时间为30 min，超声波功率为350 W，考察乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%对总黄酮提取率的影响。乙醇体积分数对冬枣核总黄酮提取率的影响见图1，最佳提取乙醇体积分数为50%。不同品种枣核中总黄酮含量各有不同，总黄酮含量提取率在1%～2%左右，而本研究所用到的冬枣核在单因素条件下黄酮提取率可达3%以上，这意味着此冬枣核的黄酮含量更为丰富，更具有开发价值。

图1 乙醇体积分数对冬枣核总黄酮提取率的影响

2.2.2 提取时间对冬枣核总黄酮提取率的影响 按照2.2.1项下称取冬枣核样品，分别加入50 mL 50%乙醇，料液比为1∶50，设置提取时间为30 min，超声波功率为350 W，考察提取时间为10、20、30、40、50 min对总黄酮提取率的影响。由图2可知，随着提取时间增加，黄酮提取率增加迅速，在30 min达到最大值。

图2 提取时间对冬枣核总黄酮提取率的影响

2.2.3 提取温度对冬枣核总黄酮提取率的影响 按照2.2.1项称取冬枣核样品，分别加入50 mL 50%乙醇，料液比为1∶50，设置提取时间为30 min，超声波功率为350 W，考察提取温度为25、35、45、55、65 ℃对总黄酮提取率的影响。由图3可知，最佳提取温度为45 ℃。

图3 提取温度对冬枣核总黄酮提取率的影响

2.2.4 超声波功率对冬枣核总黄酮提取率的影响 按照2.2.1项称取冬枣核样品，分别加入50 mL 50%乙醇，料液比为1∶50，设置提取时间为30 min，考察超声波功率250、300、350、400、450 W对总黄酮提取率的影响。由图4可知，随着超声波功率增大，黄酮提取率也增大，在400 W达到最大提取率，继续增大功率会使提取率下降。

图4 超声功率对冬枣核总黄酮提取率的影响

2.3 响应曲面实验以及结果分析

2.3.1 回归模型的建立与分析 应用Design-Expert 10软件给出设计实验29组，其中析因实验24次，中心组合实验重复5次(表2)。

表2 冬枣核总黄酮提取的响应曲面设计方案及实验结果

通过对表2的数据进行多元回归拟合分析得到模型方程，公式如下所示：黄酮提取率=2.19-0.097A+0.16B-0.094C-0.23D-0.14AB-0.55AC+0.25AD-0.16BC+0.41BD+0.12CD+0.02A2+0.3B2+0.784C2+0.23D2。从公式中可以看出：AB、AC、AD、BC几个交互作用与总黄酮提取率都呈现出负相关，BD以及CD与总黄酮提取率呈现正相关。一般根据交互作用系数大小可以判断影响大小。根据回归方程可以看出：交互作用影响大小为AC>BD>AD>B>AB>CD。

2.3.2 响应曲面拟合 根据以上结果对其进行拟合，拟合曲线以及残差正态分布图见图5。拟合曲线中所有的散点基本分布在直线的两边，呈现动态分布。残差正态分布中，大多数点呈线性关系。这表明本研究响应曲面模型拟合效果较好，结果较准确，可以用于响应曲面预测。

图5 冬枣核总黄酮提取的拟合曲线及正态分布图

表3 总黄酮提取率的方差分析表

2.3.4 单因素对总黄酮提取率影响的响应曲面图 图6.A为A与B交互作用对总黄酮提取率的影响，当因素A一定时，随着因素B的增加，响应目标总黄酮提取率先减小后增大，当因素B一定时，随着因素A的增加，响应目标总黄酮提取率变化很小，几乎忽略不计。图6.B为A与C交互作用对总黄酮提取率的影响，图形斜率变化很大，表明AC交互作用非常显著，与前面方差分析P值小于0.05显著相一致。图6.C为A与D交互作用对总黄酮提取率的影响，当因素A一定时，随着因素D的增大，总黄酮提取率不断减小，当因素D一定时，随着因素A的增大，总黄酮提取率不断减小。图6.D和F分别为B与C交互作用以及C与D交互作用对总黄酮提取率的影响，图形中心接近于圆形，表明影响不显著。图6.E为B与D交互作用对总黄酮提取率的影响，当B因素一定时，随着因素D的增大，总黄酮提取率不断减小。当因素D一定时，随着B的增加，总黄酮提取率不断减小。

图6 总黄酮提取率的影响因素二维及三维图

2.3.5 最佳工艺的预测与检验 本研究利用Design-Expert中的Optimization功能得到最佳优化方案：乙醇浓度为50%、提取时间为20 min、超声功率为350 W，提取温度为35 ℃，冬枣核黄酮粗品的黄酮提取率预测值为4.08%。在此工艺下进行5次平行实验(表4)，测定黄酮的提取率平均为4.02%，与预测值4.08%相差较小，基本符合预测值。这充分验证了回归模型的合理性，说明了响应曲面分析比较适合冬枣核总黄酮提取工艺的优化。

表4 冬枣核总黄酮提取的最佳工艺验证结果

3 讨论

本研究以滨州冬枣核为研究对象，对冬枣核总黄酮提取工艺进行优化，得到了最佳提取工艺。在该工艺指导下，所得冬枣核总黄酮提取率(4.02%)与酸枣核总黄酮(4.11%)比较接近。本研究发现，响应曲面法优化后的总黄酮提取率比单因素条件下的总黄酮提取率明显增高，原因在于响应曲面法采用多元回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，求出的回归方程精度高，还可以研究各因素之间的交互作用，比单因素条件突出显著优势，所以该法在中草药有效成分的提取工艺优化中得到广泛应用[4]。冬枣核总黄酮提取物具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等活性[3]。本研究对冬枣加工后剩余的枣核进行研究，可为滨州冬枣产业升级提供理论基础。