基于全反式维甲酸修饰白蛋白的紫杉醇纳米给药系统的构建及体外抗肿瘤效果

亓文霞 王胜兰 杨 桁 孙钰迪 王云腾 徐美琳 张 静

滨州医学院药学院 山东 烟台 264003

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是恶性肿瘤死亡的主要原因之一，且发病率和死亡率逐年上升[1]。肝癌的治疗途径包括手术、化疗和放疗等，其中化疗是目前肝癌治疗的主要手段。然而，紫杉醇(paclitaxel，PTX)等化疗药物往往存在非特异性体内分布导致全身性毒副作用、生物利用度低、长期使用易产生肿瘤耐药等缺陷，临床使用疗效不佳[2]。近年来，大量纳米给药系统已被应用于化疗药物的递送中，并被证实可以通过增强渗透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR效应)携带药物被动靶向到肿瘤部位，从而提高药物在肿瘤部位的有效浓度，同时降低药物的全身性毒副作用[3]。此外，纳米给药系统还被证实在改善疏水性药物的溶解性、提高药物的生物利用度、实现药物缓控释和联合给药等方面均表现出较好的应用潜力，有望改善肿瘤化疗效果[4]。

人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)是一种天然生物大分子，半衰期长且含有许多配体结合位点，作为疏水性药物的体内转运载体具有水溶性好、可生物降解、无毒、免疫原性低等优点[5]。HSA与化疗药物PTX自组装形成的白蛋白-PTX纳米粒Abraxane®作为基于蛋白质的纳米药物递送系统最成功的案例，己通过美国食品和药物管理局的批准并用于多种癌症的治疗，且抗肿瘤效果显著[6]。全反式维甲酸(invitroall-transretinoic acido，RA)是维生素A的主要天然代谢物，作为一种低毒性的细胞分化剂被证实可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化和细胞凋亡等途径发挥抗肿瘤作用，在恶性肿瘤治疗中具有重要作用[7]。RA可通过上调 E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达、下调波形蛋白(vimentin)表达增加细胞间的相互作用来逆转上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，诱导肿瘤干细胞分化，降低 PTX 耐药细胞的侵袭和迁移能力等多途径联合抑制 PTX 引起的肿瘤耐药和转移复发，提高肿瘤细胞对化疗的敏感性，显著改善 PTX 对多种实体瘤的治疗效果[8-9]。

本研究旨在以RA修饰白蛋白为载体构建紫杉醇白蛋白纳米给药系统PTX@HSA-RA(图1)，并从2D和3D细胞水平上对该纳米给药系统对肝癌细胞HepG2的体外增殖抑制效果进行研究，探讨其作为抗肿瘤药物递送体系的可行性。

图1 PTX@HSA-RA的制备与抗肿瘤作用示意图

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 HSA购自美国 Sigma-Aldrich 公司；N,N′二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，PTX和RA购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Hoechst 33342购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；DMEM培养基购自美国Hyclone公司。Nano ZS90纳米激光粒度分析仪购自英国 Malvern 公司；JEM-1400透射电子显微镜购自日本电子株式会社；高效液相色谱购自美国Thermo Fisher Scientific公司；TGA/DSC 3+热重及同步热分析仪购自瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；Frontier傅里叶变换红外光谱仪购自美国PerkinElmer公司；FACS Canto II流式细胞仪购自美国BD公司；TCS SPE激光扫描共聚焦显微镜购自德国LEICA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HSA-RA的合成与表征

1.2.1.1 HSA-RA的合成 以DCC/NHS为缩合剂，通过酰胺化反应将RA接枝到 HSA[10]。称取20 mg HSA溶解于9 mL 含0.05 M NaCl 的 0.1 M PBS (pH值为 8.0)中。称取RA(HSA与RA的投料摩尔比分别为1∶5、1∶10和1∶20)溶解于0.2 mL DMSO中，加入NHS和DCC(RA、NHS、DCC的摩尔比为1∶1.2∶1.2)室温下避光搅拌活化24 h。将活化后的RA溶液滴加入HSA溶液中，室温下避光搅拌反应24 h后，将反应液于去离子水中透析(MWCO 14 000 Da)48 h，5 000 r/min离心10 min，上清液冷冻干燥即得HSA-RA。

1.2.1.2 HSA-RA的表征 利用傅立叶变换红外(FT-IR)光谱对HSA-RA的结构进行确证。利用紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱测定RA的偶联度，将HSA-RA溶液适当稀释后，于349 nm处测定其吸光度值并计算其中RA浓度，利用BCA法测定其中HSA的浓度，根据以下公式计算RA的偶联度(m)。式中，WRA为溶液中 RA的质量，WHSA为溶液中HSA的质量。

1.2.2 载药纳米粒PTX@HSA-RA的制备与表征

1.2.2.1 PTX@HSA-RA的制备 采用自组装法制备载药纳米粒PTX@HSA-RA[11]。称取10 mg HSA-RA溶解于10 mL含0.05 M NaCl 的 0.1 M PBS (pH值为8.0)中。称取1 mg PTX溶解于1 mL无水乙醇中，边搅拌边将PTX的无水乙醇溶液滴加至HSA-RA溶液中。将反应液去离子水中透析(MWCO 14 000 Da)48 h，5 000 r/min离心10 min，上清液即为载药纳米粒PTX@HSA-RA悬液。

1.2.2.2 PTX@HSA-RA的表征 利用纳米激光粒度分析仪测定PTX@HSA-RA的粒径分布和表面Zeta电位，透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)观察其形貌。利用HPLC检测PTX@HSA-RA的包封率及载药量。取1 mL PTX@HSA-RA悬液分别置于37℃、含10% FBS的DMEM完全培养基和4℃、pH值为7.4 PBS中孵育7 d，检测其粒径分布与表面Zeta电位变化情况，考察其体内稳定性和储存稳定性。分别取PTX、HSA-RA、PTX@HSA-RA以及PTX与HSA-RA混合物，在 25～300℃范围内，升温速率10℃/min，氮气流量 20 mL/min 条件下进行差示热量扫描(DSC)分析。

1.2.3 PTX@HSA-RA的药物负载与释放研究

1.2.3.1 PTX@HSA-RA的包封率与载药量测定 取PTX@HSA-RA悬液 1 mL，加入 9 mL 乙腈超声提取其中的PTX，12 000 r/min离心15 min，利用HPLC测定上清液中PTX的含量。取1 mL PTX@HSA-RA悬液冷冻干燥，测定纳米粒的总质量。根据以下公式计算PTX@HSA-RA的包封率(entrapment efficiency，EE)和载药量(drug loading，DL)。式中，WNPs为PTX@HSA-RA中PTX的质量，WPTX为PTX的投药量，Wtotal为PTX@HSA-RA的总质量。

1.2.3.2 PTX@HSA-RA的体外药物释放研究 分别配制含0.2% Tween-80的不同pH值的PBS作为释放介质，研究PTX@HSA-RA在不同pH值条件下的体外药物释放情况[12]。取3 mL PTX@ HSA-RA悬液加入透析袋(MWCO 14000 Da)中，置于含30 mL 释放介质的棕色瓶中，37℃恒温振荡，于设定的时间点取样3 mL，并补充3 mL新鲜释放介质。利用HPLC 测定移出的释放介质中PTX 的含量，根据以下公式计算PTX@HSA-RA的累积药物释放率(cumulative drug release，%)，并绘制药物释放曲线。式中，M0为PTX@HSA-RA中PTX的总量，V为释放介质的总体积，n为取样次数，Vi为Ti时移出释放介质的体积，Ci为Ti时释放介质中PTX的浓度。

Cumulative drug release(%)=

1.2.4 溶血实验 利用新西兰兔红细胞对PTX@HSA-RA的血液相容性进行评价。将提取的新鲜兔血与生理盐水混匀后离心、清洗并稀释为2%的红细胞悬液。分别向2.5 mL HSA-RA溶液或PTX@HSA-RA悬液中加入2.5 mL红细胞悬液，以生理盐水为阴性对照，蒸馏水为阳性对照，37℃孵育2 h。2 500 r/min离心10 min，取上清液于545 nm 处测定吸光度值，根据以下公式计算溶血率(Hemolysis，%)。

式中，ODsample为各样品组吸光度值，ODnc为阴性对照组吸光度值，ODpc为阳性对照组吸光度值。

1.2.5 体外细胞摄取实验

1.2.5.1 荧光标记FITC@HSA-RA的制备与表征 参照1.2.2中方法，将异硫氰酸荧光素(FITC)的无水乙醇溶液滴加至HSA-RA溶液中，制备荧光标记纳米粒FITC@HSA-RA，并对其粒径分布及表面电位进行测定。

1.2.5.2 FITC@HSA-RA的体外细胞毒性研究 为避免FITC@HSA-RA悬液的细胞毒性对细胞摄取实验结果的影响，利用MTT法对FITC@HSA-RA悬液对HepG2细胞的体外细胞毒性进行研究。将HepG2细胞接种于96孔板中于CO2培养箱中培养过夜，将各孔中培养液分别更换为200 μL不同浓度的FITC@HSA-RA悬液，以培养液为阴性对照，继续培养48 h。向各孔中加入MTT继续培养4 h，弃去各孔中溶液，加入150 μL DMSO充分溶解甲臜，于酶标仪490 nm下测定各孔的吸光度值，根据以下公式计算HepG2细胞的存活率(Cell viability，%)。

式中，ODsample为样品组吸光度值，ODnc为阴性对照组吸光度值。

1.2.5.3 激光共聚焦显微镜观察 将HepG2细胞接种于激光共聚焦培养皿中于CO2培养箱中培养过夜，将各皿中培养液分别更换为1 mL不同浓度的FITC@HSA-RA悬液，继续培养2 h。弃去各皿中溶液，PBS漂洗细胞 3 次，4%多聚甲醛固定后加入Hoechst 33342 染色。PBS漂洗后，将培养皿置于激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)下观察并拍照。

1.2.5.4 流式细胞仪检测 将HepG2细胞接种于6孔板中于CO2培养箱中培养过夜，将各孔中培养液分别更换为2 mL不同浓度的FITC@HSA-RA无血清培养基溶液，继续培养一定时间。弃去各孔中溶液，PBS漂洗细胞3次，胰酶消化后离心收集细胞并重悬于0.5 mL PBS中，进样流式细胞仪(flow cytometry，FCM)检测。

1.2.6 体外细胞毒性实验 参照1.2.5.2中方法，HepG2细胞于96孔板中培养过夜后，将各孔中培养液分别更换为200 μL不同浓度的PTX@HSA-RA悬液，以培养液为阴性对照，继续培养48 h，利用MTT法研究PTX@ HSA-RA对HepG2细胞的体外细胞毒性。

1.2.7 PTX@HSA-RA对HepG2细胞3D模型的生长抑制实验 参照文献[14]，利用HepG2细胞构建体外3D细胞模型(multicellular tumor spheroids，MTCSs)，研究PTX@HSA-RA对HepG2-MTCSs的体外生长抑制情况。将HepG2细胞接种于96孔超低粘附培养板中，1 000 r/min离心5 min后置于CO2培养箱中培养至HepG2-MTCSs直径约为300 μm。向含有 HepG2-MTCSs 的孔中分别加入PTX浓度为10 μg/mL的游离PTX溶液或PTX@HSA-RA悬液，以培养液为阴性对照，继续培养 4 d。倒置相差显微镜观察 HepG2-MTCSs的形态，测量其最长直径(a)和最短直径(b)，根据以下公式计算HepG2-MTCSs的体积(V)和生长抑制率(inhibiting rate，IR,%)。式中，Vt表示游离PTX和PTX@HSA-RA悬液作用t时间后HepG2-MTCSs的体积，Vc表示相同作用时间后阴性对照组HepG2-MTCSs的体积。

2 结果

2.1 HSA-RA的表征 通过改变HSA与RA的投料摩尔比，分别合成了载体材料HSA-RA(1∶5)、HSA-RA(1∶10)和HSA-RA(1∶20)。

2.1.1 HSA-RA的FT-IR表征 HSA、RA和HSA-RA的FT-IR谱图(图2)。HSA的FT-IR光谱给出了蛋白质类的共有吸收峰，包括3 289、1 658、1 546 cm-1处酰胺结构的特征吸收和2 960、2 915 cm-1处甲基的不对称伸缩振动吸收峰。RA的FT-IR光谱显示2 930 cm-1处甲基的特征吸收峰和1 658 cm-1处羧基中C=O的特征吸收，以及922、873、825、694 cm-1处烯氢的弯曲振动峰。制备得到的HSA-RA(1∶5)、HSA-RA(1∶10)和HSA-RA(1∶20)的FT-IR光谱均给出蛋白质的特征吸收，并且HSA-RA(1∶5)在944、860 cm-1处，HSA-RA(1∶10)在954、857 cm-1处，HSA-RA(1∶20)在943、858cm-1处均出现烯氢的弯曲振动峰，证实RA与HSA成功偶联。

A. HSA；B. RA；C. HSA-RA(1∶5)；

2.1.2 HSA-RA的紫外—可见光谱表征 HSA-RA(1∶5)、HSA-RA(1∶10)和HSA-RA(1∶20)的紫外-可见光谱(图3)。HSA仅在280 nm处有最大吸收波长，而RA在349 nm处出现特征吸收峰。HSA-RA(1∶5)、HSA-RA(1∶10)和HSA-RA(1∶20)的谱图中均可明显看到RA和HSA的特征峰，证实HSA-RA的成功制备。随着RA与HSA的投料比的增加，引入HSA主链中的RA数目增加，利用紫外分光光度法测得HSA-RA(1∶5)、HSA-RA(1∶10)和HSA-RA(1∶20)中RA的偶联度分别为18.5、39.1和82.1 μg/mg。

图3 各样品的紫外-可见吸收光谱

2.2 PTX@HSA-RA的表征 载药纳米粒PTX@HSA-RA的粒径分布、多分散系数(PDI)、表面Zeta电位及包封率和载药量的检测结果(表1)。随着RA与HSA投料比的增加，PTX@HSA-RA的平均粒径从(127.0±1.1)nm增加至(155.2±2.9)nm，且包封率和载药量随之增加，这可能是由于RA偶联度增加导致HSA的疏水性增强，有利于实现对疏水性PTX的负载。在白蛋白自组装过程中，pH值<7.0且在其等电点附近时会导致蛋白质聚集，pH值>9.0时蛋白质分子间排斥力增大，都不利于纳米粒形成，因此，载药纳米粒PTX@HSA-RA在pH值为8.0条件下制备[15]。此时体系pH值高于HSA等电点，因此PTX@HSA-RA表面为负电性，且Zeta电位的绝对值随RA投料量的增加而增大，这可能与HSA表面氨基被RA取代有关。当纳米粒的粒径<200 nm时易于通过EPR效应富集于肿瘤组织周围[16-17]，因此选择粒径为(155.2±2.9)nm、RA的偶联度和PTX的包封率和载药量均较高的HSA-RA(1∶20)样品用于后续载药纳米粒的实验研究。

表1 PTX@HSA-RA的表征

利用TEM 观察PTX@HSA-RA的形貌见图4。PTX@HSA-RA呈规整的球形，粒径约为100 nm。PTX@HSA-RA悬液泛淡黄色乳光，无不溶性颗粒物，而游离RA几乎不溶，表明HSA与RA偶联后显著改善了RA的溶解性。PTX@HSA-RA分别于37℃、含10% FBS的DMEM完全培养基和4℃、pH值为7.4的PBS中储存7 d后，粒径分布和表面电位均无显著变化，表明PTX@HSA-RA具有良好的体内稳定性和储存稳定性。PTX和HSA-RA与PTX的混合物在220℃和237℃处均出现明显的熔融吸收峰和分解放热峰，表明PTX以结晶状态存在。而HSA-RA和PTX@HSA-RA的曲线中PTX的熔融吸收峰和分解放热峰均消失，表明PTX由晶态转变为非晶态，证实PTX被负载于PTX@HSA-RA中(图4)。

A. TEM照片；B. 实物图；C. 稳定性；D. DSC图

2.3 PTX@HSA-RA的体外药物释放研究 分别模拟正常生理环境(pH值为7.4)、肿瘤细胞外环境(pH值为6.5)和肿瘤细胞内溶酶体环境(pH值为5.0)对PTX@HSA-RA的体外药物释放行为进行研究。PTX@HSA-RA的药物释放具有一定的缓释效果和pH 敏感性，至72 h时pH值为5.0条件下PTX的累积释放率(63.9%)显著高于pH值为7.4(22.2%)和pH值为6.5(41.7%)条件下PTX的累积释放率，有利于减少药物在血液循环中的损失，促进 PTX 聚集在肿瘤组织并加快药物释放，从而减少PTX对正常组织的损伤(图5)。

图5 PTX@HSA-RA的体外药物释放曲线

2.4 溶血实验 通过体外红细胞溶血实验考察载体材料HSA-RA和PTX @HSA-RA的溶血率(图6)。在实验设定的浓度范围内，HSA-RA和PTX@HSA-RA的溶血率随浓度的增加均略有上升，但均低于5%，表明两者用于静脉注射给药具有良好的安全性[18]。

图6 HSA-RA和PTX@HSA-RA的溶血率

2.5 体外细胞摄取实验

2.5.1 荧光标记FITC@HSA-RA纳米粒的表征 FITC@HSA-RA的粒径分布及表面Zeta电位(图7)。FITC@HSA-RA的平均粒径为(175.4±3.4)nm，粒径呈正态分布，分布范围较窄，表面Zeta电位为(-20.1±1.5)mV，与PTX@HSA-RA的粒径和Zeta电位检测结果相似。

A. 粒径及表面Zeta电位；B. 体外细胞毒性

2.5.2 FITC@HSA-RA纳米粒的体外细胞毒性实验 MTT法检测FITC@HSA-RA的体外细胞毒性(图7)。当FITC的浓度在25～200 μg/mL范围内时，FITC@HSA-RA与HepG2细胞作用24 h后细胞的相对增殖率均高于95%，表明该浓度范围内FITC@HSA-RA对HepG2细胞无毒性，不会对细胞摄取实验结果造成影响。

2.5.3 FITC@HSA-RA纳米粒的体外细胞摄取 利用CLSM对HepG2 细胞对PTX@HSA-RA的体外摄取情况进行观察(图8)。细胞核和FITC@HSA-RA分别用 Hoechst 33342 和 FITC标记，显示为蓝色和绿色荧光。FITC@HSA-RA与HepG2细胞作用1 h后，在细胞质中可明显观察到绿色荧光分布，且随作用时间延长胞内荧光强度逐渐增强，表现出一定的时间依赖性。HepG2细胞对PTX@HSA-RA的摄取具有明显的浓度依赖性，随着FITC@HSA-RA浓度的增加细胞内荧光强度逐渐增强。FCM检测结果与CLSM观察结果一致，证实FITC@HSA-RA可被HepG2 细胞快速、持续摄取，并在细胞质中大量聚集，有助于促进药物的跨膜转运，进而改善肿瘤治疗效果。

A. 不同浓度FITC@HSA-RA与HepG2细胞作用2 h的CLSM照片；B. FITC@HSA-RA(FITC浓度100 μg/mL) 与HepG2细胞作用不同时间的CLSM照片；C. 不同浓度FITC@HSA-RA与HepG2 细胞作用2 h的FCM检测结果；D. FITC@HSA-RA(FITC浓度100 μg/mL)与HepG2细胞作用不同时间的FCM检测结果

2.6 体外细胞毒性实验 通过MTT法分别对载体HSA-RA、游离PTX和载药纳米粒PTX@HSA-RA的体外细胞毒性进行评价(图9)。不同浓度HSA-RA与HepG2细胞作用48 h后，细胞的存活率均高于90%，表明HSA-RA作为载体材料具有良好的生物相容性。随着PTX浓度的升高，PTX@HSA-RA与游离PTX对HepG2细胞的细胞毒性均随之升高。当PTX浓度为1～10 μg/mL时，PTX@HSA-RA与游离PTX对HepG2细胞的细胞毒性差异无统计学意义。当PTX浓度为0.001～0.1 μg/mL范围内时，PTX@HSA-RA纳米粒对HepG2细胞的细胞毒性明显高于游离PTX，表现出更为显著的HepG2细胞增殖抑制效果。

两组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.7 HepG2-MTCSs 的生长抑制实验 为了进一步研究PTX@HSA-RA的体外抗肿瘤效果，对PTX@HSA-RA对3D细胞模型HepG2-MTCSs的体外生长抑制效果进行研究(图10)。作用2 d后，可观察到阴性对照组HepG2-MTCSs 的体积增加，游离PTX处理组HepG2-MTCSs的体积变化较小，而PTX@HSA-RA处理组HepG2-MTCSs的体积明显减小；作用4 d后，阴性对照组HepG2-MTCSs的体积持续增加且边缘轮廓清晰，而游离PTX处理组和PTX@HSA-RA处理组HepG2-MTCSs的边缘模糊，周围可见大量细胞游离，表明HepG2-MTCSs完整性受到破坏，且PTX@HSA-RA处理组HepG2-MTCSs 的体积最小。游离PTX和PTX@HSA-RA与HepG2-MTCSs作用2和4 d时，PTX@HSA-RA处理组对HepG2-MTCSs 生长的抑制率均显著高于游离PTX处理组(P<0.01)，表明PTX@HSA-RA较游离PTX具有更强的HepG2-MTCSs生长抑制作用。

3 讨论

化疗是肝癌临床治疗中的主要药物治疗手段，PTX是临床治疗中最有效和最常用的化疗药物之一，但存在水溶性差导致生物利用度低、非特异性体内分布导致全身性毒副作用、长期使用易产生耐药等缺陷，严重限制其临床应用。本研究构建的以RA修饰白蛋白为载体的PTX白蛋白纳米给药系统PTX@HSA-RA具有较小的粒径(<200 nm)、较高的药物包封率、载药量和良好的生物相容性，有利于通过EPR效应携带PTX被动靶向到肿瘤部位，且可被HepG2细胞快速、持续摄取并在肿瘤细胞内低pH值环境中促进药物释放，从而减少血液循环中药物的渗漏，提高肿瘤部位有效药物浓度，进而改善肝癌的化疗效果。

A. HepG2-MCTSs 的显微镜观察；B. 游离 PTX 和 PTX@HSA-RA对HepG2-MCTSs的生长抑制率。两组比较，**P<0.01。

RA可以通过与特定的细胞受体和核受体相互作用而影响肿瘤细胞的生长、分化和凋亡，对多种恶性肿瘤表现出抗增殖、抗迁移和抗侵袭等活性，在肿瘤防治中具有重要作用[8-9]。因此，载体材料中RA的引入有望与PTX发挥协同抗肿瘤作用，进而提高PTX的化疗效果。MTT实验结果表明，当PTX浓度为1～10 μg/mL时，由于游离PTX可通过扩散作用直接进入细胞并发挥作用，PTX@HSA-RA与游离PTX对HepG2细胞的细胞毒性未表现出显著差异；而当PTX浓度为0.001～0.1 μg/mL时，PTX@HSA-RA对HepG2细胞的细胞毒性明显高于游离PTX，这可能与PTX@HSA-RA促进PTX通过胞吞作用跨膜转运有关。此外，PTX@HSA-RA中的RA与PTX也可能发挥了协同抗肿瘤作用，因而表现出更为显著的HepG2细胞增殖抑制效果。

与通过单层细胞培养来研究纳米给药系统对肿瘤细胞的抑制增殖效果的MTT实验相比， 构建3D细胞模型(MTCSs)对纳米给药系统对其生长抑制作用进行研究能够更准确地模拟体内实体瘤内细胞—细胞间以及细胞—细胞基质间的复杂结构的复杂结构来评价纳米给药系统的体外抗肿瘤效果[19]。PTX@HSA-RA表现出较游离PTX更强的HepG2-MTCSs生长抑制作用，这可能是由于PTX@HSA-RA具备一定的肿瘤深部渗透能力，可以携带药物向 HepG2-MTCSs 中心递送而不是仅分布在其外表面，从而促进 PTX 对 HepG2-MTCSs 生长的抑制作用，最终导致3D细胞结构完整性的破坏。尽管PTX@HSA-RA作用4 d后HepG2-MTCSs的结构并未被完全破坏，但该结果仍提示PTX@HSA-RA具有提高PTX体内抗肿瘤活性的潜力。

综上所述，本研究成功构建了以RA修饰白蛋白为载体的PTX白蛋白纳米给药系统PTX@HSA-RA，并证实其具有较好的生物相容性和较高的包封率与载药量，可对PTX进行缓释且具有一定的pH值敏感性，可被HepG2 细胞快速、持续摄取而实现PTX的胞内递送，相较游离PTX表现出更强的体外细胞毒性和HepG2-MTCSs生长抑制作用，是一种具有良好研究应用潜力的抗肿瘤药物递送系统。后续研究中将结合动物实验对PTX@HSA-RA的体内抗肿瘤效果进行进一步研究，以期为肝癌治疗提供一种新型高效的给药途径。