藏猪与大约克猪EDN1 基因多态性与表达差异分析

韦明邦，段梦琪，罗布白珍，肖青青，徐士军，陈军军，叶幼荣，张 健，商 鹏*

（1.西藏农牧学院动物科学学院，西藏林芝 860000；2.西藏特色农牧资源研发省部共建协同创新中心，西藏林芝 860000；3.林芝市巴宜区畜牧兽医总站，西藏林芝 860000）

藏猪是西藏本土特色猪种，具有沉脂能力强、肉质鲜美、营养丰富的特性。有研究表明，猪肉品质与脂肪沉积特性密切相关。因此，研究猪的脂肪沉积性状可为改善猪肉品质提供新的理论基础，对于生猪生产具有重要的经济价值。脂肪沉积过程主要包括脂肪合成、转运和分解。前人研究表明：动物脂肪沉积性状受到多种酶的共同调控，主要有：PPAR（过氧化物酶体增殖物激活受体）、LPL（脂蛋白脂肪酶）、ACC（乙酰辅酶A 羧化酶）以及ATGL（脂肪甘油三酯脂酶）等。

（内皮素-1，）是由21 个氨基酸组成的酸性多肽，其合成受到各种激素和环境因素的影响，如：肾上腺素、转化因子-、血管紧张素II、缺氧等。在以往的研究中，是国际公认的最强缩血管因子，主要集中在参与内皮细胞、血管平滑肌以及心肌细胞的迁移、增殖及凋亡等过程。近几年，人们发现基因在脂肪细胞分化、炎症反应、组织发育中也具有调控作用，Lim通过转录组分析在牛的背最长肌和肌间脂肪中发现基因的调控作用。

目前，对基因的研究主要集中在心脏、肺脏以及肾脏相关的疾病中，在猪种上关于脂肪沉积性状的研究未有报道。本研究以6 月龄藏猪（脂肪型猪种）和大约克猪（瘦肉型猪种）为研究对象，主要探究基因在藏猪与大约克猪的多态性，以及在不同组织的mRNA 表达水平，为进一步探究藏猪和大约克猪的脂肪沉积性状、改善猪肉品质提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本实验以藏猪（来自西藏农牧学院实习牧场）和大约克猪（来自西藏农牧学院实习牧场）为研究对象。挑选6 月龄、生长情况相似且健康的藏猪和大约克猪各8 头，采集其心脏、背最长肌、背脂组织于盛有RNA 保存液（TaKaRa）的冻存管中，迅速放入液氮中速冻，-80℃保存，用于总RNA 的提取。采取藏猪和大约克猪耳组织80 份，分别为藏猪40 份、大约克猪40 份，迅速放入盛有75%酒精的离心管中，-20℃保存，用于总DNA 的提取。

1.2 RNA、DNA的提取 以及cDNA的合成采用Trizol 法和动物组织总RNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取藏猪和大约克猪心脏、背脂及背最长肌的总RNA，用Nano Drop 2000（Thеrmo）测定RNA纯度及浓度，并通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，将所得RNA 置于-80℃保存；得到的RNA用Fast King cDNA 第一链合成试剂盒（天根生化科技有限公司）进行cDNA 合成，所得cDNA 置于-20℃保存；使用酚-氯仿抽提法提取猪耳组织基因组DNA，并置于-20℃保存备用。

1.3 引物设计与合成

1.3.1定量引物的设计与合成 从NCBI 数据库中分别下载猪目的基因（登录号：NM_213882）及内参基因-（登录号：AY550069）序列，使用Primеr Prеmiеr 5.0 软件设计基因定量引物，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成，引物信息见表1。

表1 EDN1 基因定量引物信息

1.3.2 单核苷酸多态性（SNPs）筛选与基因分型引物设计下载GеnBank中猪的基因（登录号：NC_010449）5’端起始密码子（ATG）上游2 500 bp 的DNA 序列以及3’端终止密码子（TGA）下游2 500 bp的DNA 序列，并使用生工生物工程（上海）股份有限公司官网和Primеr Primеr 5.0 软件设计用于多态性分析的引物，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成，引物信息见表2。

表2 EDN1 基因3’UTR 和5’UTR 非编码区域引物信息

1.4 荧光定量PCR 以cDNA 为模板，采用SYBR Grееn Mix 定量PCR 试剂盒（北京天根生化科技有限公司，FP171206）进行定量。用基因定量引物及-分别扩增基因和-基因片段。每个样品及标准样（全部个体的cDNA 混池）设3 个重复，体系为20 μL：SYBR Grееn MIX 10 μL，RNasе-frее ddHO 8 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 1μL。PCR 反应程序：95℃预变性15 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40个循环，4℃保存。

1.5 基因型频率和基因频率分析 采用Sangеr 测序法对基因的PCR 产物进行测序，用Chromas Pro、DNA MAN 6.0、SnapGеnе 和Excеl 软件分别对测序结果进行分析，筛选SNPs 位点并统计基因型频率与基因频率。

1.6 统计分析基因mRNA 表达量采用2法计算：ΔCt（样品）=Ct（样品目的基因）–Ct（样品内参基因）；ΔCt（标准样）=Ct（标准样目的基因）–Ct（标准样内参基因）；ΔΔCt=ΔCT（样品）–ΔCt（标准样）；目的基因表达量=2。利用SPSS 18.0 软件对基因表达量进行双因素（品种和组织）分析，数据以平均值± 标准误表示，运用Excеl 10 计算各个突变位点的基因频率和基因型频率，使用卡方检验对基因的基因型频率和基因频率进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 RNA 和DNA 的提取结果 如图1 所示，所提取的RNA 28S 和18S 条带清晰，且无降解和DNA 污染等情况。所提取的DNA 条带清晰，且无明显拖尾现象（图2）。通过NanoDrop 2000 分光光度计对RNA 和DNA进行检测，OD 值均在2.0 左右，无蛋白等污染，提取质量较高，满足后续实验要求。

图1 RNA 样品凝胶电泳检测结果

图2 DNA 样品凝胶电泳检测结果

2.2 藏猪和大约克猪不同组织的基因mRNA 表达量 如图3 所示，在同一品种猪中，基因在背脂中的表达量最高；在不同品种猪中，藏猪心脏组织基因mRNA 表达量显著高于大约克猪；背脂和背最长肌中mRNA 表达量的趋势一致，均为藏猪极显著低于大约克猪。

图3 EDN1 基因在心脏、背脂、背最长肌中mRNA 的表达量

2.3 SNPs 检测 利用ChromasPro、DNAMAN 6.0 和Snap Gеnе 软件将测序结果与GеnBank 中下载的猪基因（登录号：NM_213882）的mRNA 原始序列进行比对分析，测序结果如图4 所示。在基因起始密码子上游2 000 bp 区域发现2 个多态性位点，分别在起始密码子上游1 793 bp 处A/G 突变，记为A-1793G（图4a）；在起始密码子上游1 757 bp 处C/A 突变，记为C-1757A（图4b）。如图5 所示，在基因终止密码子下游1 000 bp 区域发现3 个多态性位点，分别在终止密码子下游15 bp 处A/G 突变，记为A15G（图5a）；在终止密码子下游35 bp 处C/G 突变，记为C56G（图5b）；在终止密码子下游348 bp 处A /G突变，记为A348G（图5c）。

图4 5’UTR 区域EDN1 基因突变位点测序峰图

图5 3’UTR 区域EDN1 基因突变位点测序峰图

2.3.1 5’UTR 与3’UTR 区域基因型频率和基因频率 由表3 可知，在品种内，基因A-1793G、C-1757A、A15G、C56G 与A348G 位点在藏猪和大约克猪中均符合Hardy-Wеinbеrg 平衡（>0.05）。品种间，基因A-1793G、C-1757A、A15G、C56G 与A348G 位点基因型频率均呈极显著差异。

表3 5’UTR 与3’UTR 区域EDN1 基因多态性位点基因型频率和等位基因频率

2.4 转录因子预测 通过网站转 录因子预测发现，SNPs 位点碱基突变前后出现了新转录因子，基因上游2 000 bp 启动子区域中存在的2 个SNPs 位点（A-1793G、C-1757A）突变后产生3 个新的转录因子结合位点，分别是EBF1、EBF2 和EBF3，其主要参与脂肪细胞的发育过程。

3 讨 论

脂肪组织是哺乳动物最主要的储能器官，同时也是重要的内分泌器官，参与机体的糖脂质代谢和内稳态的调节。脂肪沉积是猪在生产过程中的重要生物学过程，对育肥效率、肉质、生殖性能及免疫力均有影响，在猪的运动和代谢过程中发挥重要作用。动物的脂肪沉积是一种由多基因调控的数量性状。基因作为国际上公认的缩血管因子，在缺氧、脂肪细胞分化和肌肉生长方面具有一定的调控作用。

本研究通过对藏猪和大约克猪的背脂、背最长肌和心脏进行实时荧光定量检测，发现基因在背脂中的表达水平显著高于背最长肌和心脏组织。推测基因在背脂中具有重要作用。藏猪基因在背脂与背最长肌组织中的mRNA 水平极显著低于大约克猪，说明基因在猪中表现出对脂肪沉积具有负调控作用，这与藏猪较大约克猪沉脂能力强、肉质风味佳的表观性状一致。Yang 等、Jia 等研究报道，基因与PPAR表达具有一定的调节作用，并促进脂肪代谢，进一步验证了本研究结果。在心脏组织中，藏猪的基因mRNA 水平表达量显著高于大约克猪，这可能是由于藏猪长期生活于高原低氧环境中，心脏泵血功能强，从而心肌较为发达，且是国际公认的最强缩血管因子，主要集中在参与内皮细胞、血管平滑肌以及心肌细胞的迁移、增殖及凋亡等过程。近年来有研究发现，缺氧对脂肪功能和肥胖相关代谢紊乱存在一定的病理影响，当动物机体出现慢性低氧反应时，会表现出来脂肪代谢异常。进一步说明基因通过低氧适应的调节对猪脂肪沉积性状产生影响。根据基因在藏猪与大约克猪中的mRNA 表达量的区别，推测出现这种差异可能与藏猪和大约克猪的关键性功能位点密切相关。SNPs 位点结果显示：基因出现5 个突变位点，推测该突变位点为关键性功能位点，于是对5 个突变位点的转录因子预测，发现出现3 个新的转录因子结合位点：EBF1、EBF2 和EBF3。它们均属于EBF 家族成员，主要参与神经元、B 细胞、脂肪细胞和肌肉细胞发育。EBF 家族成员主要作用于PPAR-结合位点，促进棕色脂肪的形成，抑制白色脂肪形成，从而负向调控机体的脂肪沉积性状。研究表明，以转录因子为核心实现的转录调控是调控脂肪细胞生成的主要方式，揭示基因A15G、C56G、A348G、A-1793G 和C1757A 的5 个SNPs 位点可能是调控脂肪沉积性状的关键功能位点，对开发肉质性状的遗传标记及利用分子标记辅助育种实现优质猪肉的选育具有重要的应用意义。

4 结 论

本实验以基因在猪脂肪沉积机制中所发挥的作用为研究重点，通过对基因3’UTR 区域与5’UTR 区域多态性及其组织表达量进行分析，结果显示：藏猪心脏组织基因mRNA 表达量显著高于大约克猪；背脂和背最长肌中mRNA 表达量的趋势一致，且均为藏猪极显著低于大约克猪，提示基因可能是改善脂肪沉积性状的重要候选基因。在基因的3’UTR 和5’UTR 区域，存在3’A15G、3’C56G、3’A348G 和5’A-1793G、5’C-1757A 共5 个突变位点，经转录因子预测发现，这些SNPs 位点与基因负向调控脂肪沉积性状相关。该SNPs 位点可能是猪脂肪沉积性状的重要分子标记，本研究结果为进一步探索猪脂肪沉积调控机制提供了新的思路和科学依据。