白蚁共生微生物资源的发掘及其在反刍动物上的开发前景

郭 成，孙晓格，郝阳毅，徐晓锋*，李胜利,*

（1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；2.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193）

粗纤维主要成分包括纤维素、半纤维素、木质素，其中木质素是一种由一系列碳氧键和碳碳键形成的具有三维网状结构的天然无定形有机聚合物，并与纤维素和半纤维素一起构成植物细胞壁，在生物质资源中普遍存在。粗纤维在地球上分布广泛，是最为丰富的可再生资源。但是由于粗纤维的结构复杂，其降解需要多种微生物及多种酶协同互作。反刍动物由于其特殊的生理结构，可以对纤维素利用。农业废料（如秸秆、糟渣等）含有大量的粗纤维均可作为反刍动物粗饲料的来源。这些粗饲料在瘤胃微生物的共同作用下，最终发酵降解为挥发性脂肪酸，作为营养物质被反刍动物瘤胃吸收。粗饲料在反刍动物日粮结构中占据重要地位，精饲料添加过多会导致反刍动物瘤胃酸中毒或亚急性酸中毒（Sub-Clinical Rumеn Acidosis，SARA），当瘤胃处于酸中毒或者SARA 时，瘤胃发酵模式和乳腺脂肪酸的分泌都会发生改变。研究表明，当奶牛发生亚急性酸中毒时可引起乳脂下降，粗饲料在日粮中的比重直接影响奶牛乳脂的合成。尽管粗饲料对反刍动物意义很大，但是反刍动物对粗饲料中粗纤维的降解作用有限，从反刍动物粪便中回收的纤维仍然可以被发酵。

饲料中的粗纤维影响反刍动物的消化，粗纤维的含量与反刍动物对饲料干物质的消化率呈负相关。当反刍动物粗饲料品质不高（木质素过多）时，会加剧反刍动物温室气体的排放，造成饲料能量损失，还会降低反刍动物的生产性能。因此，探究粗纤维高效利用、提高反刍动物的饲料消化率对养殖业高质量生产、降低成本以及环境可持续发展有重要意义。类似于反刍动物，自然界也有很多昆虫可以利用其胃肠道的微生物互作来降解粗纤维。早有研究从昆虫中发掘了具有粗纤维降解能力的微生物。由于白蚁（Tеrmitе）对粗纤维有高效的降解能力，近年来也被国内外学者关注。本文综述了白蚁高效降解粗纤维体系的机制以及白蚁在反刍动物上的开发前景，为白蚁生物资源在反刍动物上的应用提供理论依据。

1 白蚁的分类及消化特点

白蚁分为低等和高等两大类，高等白蚁后肠没有原虫，且高等白蚁的消化结构相对低等白蚁更复杂，消化道比低等白蚁更长。

白蚁的消化道分为前肠、中肠和后肠，其中前肠和中肠较小，后肠结构十分复杂，分别为肠道瓣前节（P1）、肠道瓣（P2）、发酵室（P3）、结肠区（P4）以及直肠区（P5），其中后肠的P3 区显著膨大，白蚁的P3、P4、P5 区中存在大量的共生微生物，可以帮助白蚁更加高效地利用粗纤维。白蚁是自然界为数不多的粗纤维高效降解者，白蚁能够利用其肠道内的共生微生物（如细菌、古细菌、真菌）及低等白蚁肠道内特有的原生动物等产生的粗纤维降解酶类来降解粗纤维。研究表明，在白蚁肠道内微生物作用下，食物中的65%～87%半纤维素、74%～99% 纤维素及25%～100% 木质素可被白蚁降解，其降解粗纤维的效率显著高于瘤胃。

低等白蚁可以利用体内原虫吞噬前肠、中肠初步消化的粗纤维，最终将其降解生成乙酸、二氧化碳和氢。高等白蚁取食木材后，在后肠通过内源性纤维素酶以及大量的纤维素降解菌相互作用，最终将粗纤维降解为乙酸、丙酸等短链脂肪酸以及二氧化碳和氢。尽管白蚁自身能够产生内源性粗纤维降解酶，但只有在肠道微生物的帮助下，才可以完全实现其对粗纤维的利用。正是由于白蚁与其肠道菌群巧妙的互作，使得粗纤维可以被高效降解，而粗纤维的最终降解产物是乙酸以及其他挥发性脂肪酸。挥发性脂肪酸是反刍动物能量的主要来源，可以直接由瘤胃吸收。因此，进一步开发白蚁降解纤维的微生物并在反刍动物上合理运用，可以提高反刍动物饲料的转化率，具有广阔的发展前景。

2 白蚁降解纤维的共生微生物研究

2.1 白蚁肠道内纤维素降解细菌的多样性 对白蚁肠道纤维降解细菌的传统研究，一类是先利用合适的培养基（如刚果红）进行培养，分离并筛选，然后在合适的培养基上继续实现纯培养进行后续研究，观察其生长状况及检测各种理化指标的变化；另一类是利用现代分子生物学技术（如高通量测序技术、宏基因组学技术等）对其肠道菌群进行整体探究。研究表明，在白蚁肠道内附着大量不同的细菌，每只白蚁肠道中的细菌数量大约可达10～10个。白蚁肠道共生细菌在其消化粗纤维过程中发挥着重要作用。

虽然原虫在低等白蚁粗纤维消化中占据主要作用，但是细菌对粗纤维的消化作用不可忽视。研究表明，在食木性低等白蚁后肠内螺旋体门细菌数量可占原核生物的二分之一，可以与鞭毛虫共生，但大多数游离在白蚁后肠体液中。而且许多细菌和古细菌还可以与鞭毛虫形成共生关系，主要位于鞭毛虫的细胞质以及外表面。Huang 等测定了一种低等白蚁肠道菌群的多样性，发现其肠道中细菌种类十分丰富，其中螺旋体门（Spirochaеtеs，37.4%）丰度最高，其肠道优势菌群还包括迷踪菌门（Elusimicrobia，32%）、厚壁菌门（Firmicutеs，11.4%）、疣微菌门（Vеrrucomicrobia，10.1%）、变形菌门（Protеobactеria，6.4%）等。Ali等从低等白蚁的肠道中分离出33 种不同的细菌，并从中分离出5 种纤维降解菌，利用16S r RNA 测序技术鉴定为乳酸芽孢杆菌（）、大溶芽孢杆菌（）、嗜麦芽窄食单胞菌（）、纺丝芽孢杆菌（）和蜡样芽孢杆菌（）。

高等白蚁肠道中缺少原虫，主要利用细菌和古细菌等微生物降解粗纤维。Chеw 等利用16S rRNA 测序技术，对一种高等白蚁肠道菌群的V3-V4 区进行测序分析，结果发现该白蚁前肠和中肠的菌群以杆菌、梭菌门、厚壁菌门和放线菌门为主，而在后肠中发现的主要菌群为螺旋体门。周峰对土白蚁属白蚁、黑翅土白蚁和2 个长鄂土白蚁进行肠道细菌多样性分析，发现在门水平上细菌多样性分布较为一致，包括拟杆菌门（Bactеroidеtеs）、厚壁菌门（Firmicutеs）和变形菌门（Protеobactеria），其中优势菌为拟杆菌门和厚壁菌门；还通过体外分离培养技术成功筛选到了木质素降解菌，如肠杆菌属（）、沙门菌属（）、柠檬酸杆菌属（）、泛菌属（）、微小杆菌属（）以及芽孢杆菌属（）等。

2.2 白蚁共生真菌的作用 培菌类白蚁对真菌利用较多，该白蚁属于大白蚁亚科，为高等白蚁。这类白蚁最大的特点就是其可以在菌圃内培养真菌，并将其取食利用。其中最主要的为蚁巢伞菌（）属真菌。真菌的主要作用有降解木质素以促进纤维素的降解、提供一些粗纤维相关的降解酶类、与白蚁自身分泌的酶协同作用等。Gangwar 等将OE147 液体培养后，检测到培养液中含有漆酶、纤维二糖脱氢酶和过氧化物酶，同时在蚁巢伞的液体培养液中检测到大量的漆酶和微量的木质素过氧化物酶。有研究认为，白蚁培养真菌可能是由于自身分泌的降解木质素的酶不足以满足需要。李静对3 种散白蚁工蚁及其肠道微生物进行转录组测序，结果发现其中有8个漆酶基因的表达水平在尖唇散白蚁中显著高于其他2种散白蚁；在观察试验中，尖唇散白蚁不会利用真菌.，但是其他2 种白蚁会将该真菌的菌核搬运巢中培养，可能是2 种散白蚁自身内源性木质素酶分泌不足，以取食菌核萌发菌丝的方式提高木质素的降解效率。

以往对白蚁肠道内共生真菌的报道较少，或者认为真菌对白蚁消化作用帮助不大。近年来，随着研究方法的改进，白蚁肠道的共生真菌也被进一步发掘。Samеh 等在黑胸散白蚁的肠道中成功分离并鉴定了18 种酵母菌，这些酵母菌具有很高的木聚糖分解活性以及-木糖发酵能力。Xu 等从台湾白蚁中分离纯化了39 种真菌，经鉴定隶属于4 个纲，分别为粪壳菌纲（Sordariomycеtеs）、座囊菌纲（Dothidеomycеtеs）、虫囊菌纲（Eurotiomycеtеs）、伞菌纲（Agaricomycеtеs）。可见，真菌对白蚁消化粗纤维的作用不可忽视。

2.3 原虫对低等白蚁的重要性 低等白蚁的粗纤维消化主要在后肠P3 区，其中含有大量的原虫，而鞭毛虫类（Flagеllatеs）是肠道中最重要的原生动物，它们的质量甚至可以达到低等白蚁总体重的1/7～1/3，能占据着后肠90% 以上的空间。原虫对低等白蚁体内粗纤维降解过程有关键作用。Clеvеland早在1926 年就发现鞭毛虫可以降解纤维素。据报道，如果通过饥饿或高压氧处理，使低等木食性白蚁体内的鞭毛虫消失，再给白蚁饲喂木头，虽然白蚁仍然会取食，但是几周以后白蚁还是会因饥饿而死亡；而喂食淀粉类食物或者重新接种鞭毛虫，则低等白蚁仍然可以存活。现代分子生物学的发展大大加速了人们对白蚁肠道原虫的认识。陈文等利用18S rDNA 技术，对黑胸散白蚁的锐滴虫目鞭毛虫进行了鉴定，结果表明在黑胸散白蚁肠道共生的锐滴虫为和属的鞭毛虫。随着研究的深入，人们认识到不同纤维素食物对低等白蚁鞭毛原生生物群落结构也会产生影响。研究表明，白蚁共生鞭毛原生生物群落是一个动态的组合，能够适应不同的条件和饮食，低等白蚁体内原虫丰度的变化与营养条件呈显著相关。Duartе 等对同一蚁群的白蚁饲喂了6 种不同饲粮，结果发现所有未经处理的木材产生了相似的鞭毛原生生物群落，这些群落更加多样化；相反，用纤维素直接饲喂的白蚁体内鞭毛虫多样性显著低于饲喂未经处理的木材组。

3 白蚁降解纤维的共生微生物在反刍动物中的应用前景

3.1 白蚁纤维降解微生物在反刍动物上的开发 在肠道微生物的帮助之下，白蚁才能对粗纤维高效降解。大量研究结果表明，白蚁体内存在高效的纤维降解菌，且这些菌群一般在瘤胃中缺乏或丰度不够。有研究表明，白蚁细菌和瘤胃细菌的组合在降解纤维饲料中具有协同关系。Azizi 等从白蚁肠道分离出地衣芽孢杆菌（）、中间苍白杆菌（）、沼泽微杆菌（），并利用3 种菌对海枣叶和麦秸进行预处理及瘤胃体外发酵，发现3 种纤维菌改变了海枣叶和麦秸的化学成分，提高了营养物质的消化率，表明这三种菌在反刍动物上有开发价值。

菌群移植是一种很好的开发白蚁粗纤维微生物的方法，大量研究表明菌群移植对反刍动物有利。虽然反刍动物的微生物消化强于单胃动物，但在单胃动物上对白蚁纤维降解菌移植的研究却早于反刍动物。李蕊蕊等给家鹅饲喂了3 种纤维素分解菌，并分别从鹅肠道、白蚁肠道、牛粪中分离纤维菌，结果表明饲喂3 种纤维分解菌均提高了鹅的日增重、采食量，显著降低了耗料增重比，并且饲喂白蚁肠道内分离的纤维降解菌效果最好。关于白蚁粗纤维分解菌移植在反刍动物上的研究报道较少。Ayoub 等将3 种白蚁消化道分离的纤维降解菌转移到绵羊瘤胃液中，发现移植3 种纤维降解菌均可增加体外原生动物和蛋白水解菌的数量，提高了瘤胃的蛋白酶活性浓度。对白蚁纤维降解菌进行移植虽然对反刍动物有积极影响，但是与同菌群移植的通病相同，只能暂时调控微生物，寻找保持瘤胃微生物的积极效应以及让有益菌定植的方法为当前重要任务。

3.2 纤维降解的相关酶及工程菌的开发 由于白蚁对粗纤维降解非常高效，因此筛选并对白蚁体内利用粗纤维的细菌进行鉴定，或利用其相关的纤维素酶基因来重新构建可降解粗纤维的人工重组菌，具有重大的理论与应用价值。马玉俊等采用传统培养分离的方法，将白蚁肠道产纤维素酶菌株进行纯化，并使用16S rDNA 技术对其进行鉴定，分离并筛选出了10 株产纤维素酶菌株，且坚强芽胞杆菌（）的纤维素综合酶活力最高。李锋等从白蚁肠道中筛选出木质素降解菌，对其进行16S rRNA 基因序列鉴定的结果显示，该菌株为解鸟氨酸拉乌尔菌，以碱木质素为唯一碳源，木质素降解率可达53.2%，漆酶和木质过氧化物酶活力最大，分别为32 U/L 和105.6 U/L。高云航等从白蚁肠道中筛选出蜡样芽孢杆菌，其滤纸酶活性可达6.05 U/mL，为高效纤维降解菌。

随着基因克隆技术的发展，已对多种外源基因克隆到不同的表达载体中进行了研究。杜娇等将漆酶、木聚糖酶、内切-1,4-葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶4 种白蚁来源的酶在大肠杆菌上进行共表达，结果表明共表达的酶降解效率高，且高于单组分液降解效率的总和。苏丽娟等对近暗散白蚁的-葡糖苷酶7 的基因进行了克隆，并在毕赤酵母菌上成功表达，其酶活性为7.47 U/mL。Zhang 等对克隆于台湾乳白蚁的内源性纤维素酶基因也进行了分子改造，在大肠埃希菌中进行过量表达，所产酶对羧甲基纤维素和滤纸均表现出较高的水解活性。王智伟等从黑胸散白蚁中筛选出枯草芽孢杆菌，并将该菌的2 个产纤维素酶基因和进行原核融合表达，表达出一个酶活性更高的纤维素酶蛋白。工程菌的开发对反刍动物饲料工业有着重大意义，如利用白蚁重组工程菌进行酶制剂的开发、定植菌的培养等都有着广阔前景。将产粗纤维酶的基因异源表达是一种很好的方式，但可能存在酶活力不足、稳定性不够以及对瘤胃内环境的耐受性等问题。

3.3 白蚁对反刍动物粪便的处理 随着现代畜牧业的发展，越来越多的散户养殖被大规模养殖场取代，随之而来的环境问题也日益增多。受日粮等多种因素影响，反刍动物粪便通常呈碱性。过去，由于养殖规模以及处理技术有限，常使用堆肥技术将养殖粪污还于田间。反刍动物，特别是奶牛对热应激敏感，越来越多的企业将大规模养殖场建立在北方，尤其是西北。大规模的养殖粪污如果仍然还于田间则会加速当地农田的盐碱化程度，加剧可耕种农田的荒漠化程度。在自然界，白蚁也承担分解者的角色，利用其他动物粪便未消化的纤维以及其他营养物质满足自身需要。研究表明，在条件允许的情况下，一些白蚁更倾向于取食牛粪，这是由于反刍动物粪便中粗纤维含量相较于单胃动物更高，白蚁更容易利用。粪便是可利用资源，只要处理得当，是优质肥料。而在实际生产中，粪便的利用需要进行预处理，而关键技术就是对木质纤维素的预处理。王成盼对比了白蚁取食农业废弃物（包括牛粪）和林业废弃物后的新建菌圃，发现白蚁在取食牛粪后新建菌圃呈酸性，且取食牛粪后新建菌圃的木质素含量明显低于取食林业废弃物新建菌圃。此外，国外还有人利用白蚁丘作为配制堆肥的膨松剂，显著提高了堆肥品质。可见，利用白蚁处理反刍动物粪污存在理论可能。

4 小结及展望

白蚁是自然界中高效的粗纤维分解者，在反刍动物上有广阔的应用前景。目前，白蚁肠道纤维降解微生物的分离、筛选技术已经成熟。随着新一代测序技术的发展，在不用分离筛选的情况下也可以对白蚁肠道菌群进行鉴定。近年来，由于分子生物技术的改进，白蚁肠道微生物分泌纤维素酶的基因被进一步发掘并研发出新的工程菌，这对于反刍动物饲料工业的发展有着重要意义。利用新技术开发酶制剂、益生菌以及其他饲料添加剂是利用白蚁共生微生物资源的一个方向，而且利用白蚁资源处理反刍动物粪污也存在可能。然而，白蚁资源在反刍动物上的研究大多数只停留在初步的实验室阶段，少有试验将白蚁资源在实际生产进行研究，且其在实际生产上的利用（如菌群移植技术）也有自身限制，相关研究还不够充足。今后，应该对已发掘的白蚁高效纤维降解菌进一步开发和探索，最终应用于实践，服务于反刍动物生产。