基于转录组的不同火龙果品种抗性差异分析

李健星 谭艳芳 李冬兴 王斌 陈婷 黄甫昭 陆树华

摘 要：  不同的品種抗性不同，为进一步探究不同火龙果品种之间的抗性差异，为后续火龙果抗性育种提供参考，该研究利用Illumina HiSeq 2000 测序平台对‘普通白肉（BR）和 ‘厄瓜多尔黄龙（EY）两个品种进行转录组测序分析，并参考GO Ontology、KEGG等公共数据库对差异表达基因进行功能分类与富集分析。结果表明：（1） BR与EY共有14 248个差异基因，其中5 446个基因上调，8 802个基因下调。（2） 相关GO功能分析表明这些差异基因主要参与酶催化活性、细胞组分、代谢过程等，其中参与氧化还原酶活性的349个差异基因在BR中表达量上调。（3）KEGG通路分析显示，大部分差异基因富集在新陈代谢和生物合成等，其中参与角质、木栓质和蜡质生物合成的差异基因有12个，如CYP86和CER1等。参与氧化还原酶活性的差异基因在BR中较EY表达量上调，且显著富集，表明BR与EY在生长发育和细胞代谢过程差异显著。参与角质、木栓质和蜡质生物合成的差异基因在BR中表达量上调，此类基因在BR中具有较高的表达量且显著富集，表明BR可能具有较强的抗旱和抗病能力。

关键词： 火龙果， 转录组， 品种， 差异表达基因

中图分类号：  Q943

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2022）02-0183-08

收稿日期：  2021-07-04

Resistance difference between different varieties of

pitaya based on transcriptome data

LI Jianxing1，2， TAN Yanfang1， LI Dongxing1，2， WANG Bin1，2， CHEN Ting1，2，

HUANG Fuzhao1，2， LU Shuhua1，2*

（ 1. Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China;

2. Guangxi Key Laboratory of Plant Conservation and Restoration Ecology in Karst Terrain， Guangxi Institute of Botany，

Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China ）

Abstract：  Different varieties have different resistances. In order to further explore the resistance differences in different varieties of pitaya and to provide a reference for further study on breeding of pitaya resistance， we used Illumina HiSeq 2000 sequence platform to sequence the transcriptomes of ‘Putongbairou （BR） and ‘Ecuador Yellow （EY）. Functional classification and enrichment analysis of differentially expressed genes （DEGs） were performed by reference to GO Ontology， KEGG and others databases. The results were as follows： （1） There were 14 248 DEGs between BR and EY， of which 5 446 genes were up-regulated and 8 802 genes were down-regulated. （2） GO functional analysis showed that these DEGs were mainly involved in enzyme catalytic activity， cell components， metabolic processes， etc. Among them， there were 349 differential genes involved in oxidoreductase activity. （3） KEGG pathway analysis showed that most of the DEGs were enriched in metabolism， biosynthesis， etc.， and 12 key genes such as CYP86 and CER1 involving in cutin， suberine and wax biosynthesis. We found that the expressions of DEGs involved in oxidoreductase activity were higher in BR than those in EY， which significantly enriched， indicating that may be significant differences in growth and cell metabolism between BR and EY. DEGs involved in the cutin， suberine and wax biosynthesis were up-regulated in BR， and such genes had higher expressions in BR， and were significantly enriched， which suggest that BR may be superior drought and disease resistance than EY.

Key words： pitaya， transcriptome， varieties， differentially expressed genes

火龙果属仙人掌科（Cactaceae）、量天尺属（Hylocereus Britton & Rose）或蛇鞭柱属（Selenicereus Britton & Rose）植物，营养美味以及独特的外观使其成为消费者追捧的新兴热带水果（陶金等， 2014）。近几年，我国火龙果产业发展迅猛，据最新数据，截至2020年底，全国火龙果种植面积已超过100万亩，并形成以广西、广东、海南、云南和贵州五省（区）为核心的主产区。特别近年来在广西石漠化区推广种植成功，形成贫困山区脱贫致富双赢的“果化模式”，火龙果耐旱、耐瘠，有利于石山地区水土保持，在改善生态环境的同时又可增加可观的经济效益。作为一种新兴水果，近年来国内外对火龙果的研究也越来越深入，主要集中在不同品种的理化性质和营养价值、功能性物质提取、栽培技术、病虫害研究（赵志平 和 杨春霞，2006;Menezes et al.， 2015;陈煜等， 2017; 彭金轮，2017;Kee et al.， 2019; Magalhes et al.， 2019; Rahmati et al.， 2019），转录组测序与微卫星引物开发（杨仕美等， 2018;武志江等， 2020），属间亲缘关系、杂交及新品种的培育（Tel-Zur et al.， 2004a， b， 2011， 2012;Ortiz-Hernández & Carrillo-Salazar，2012）等方面。

量天尺属含有14个种，世界范围内广泛栽培的火龙果主要为量天尺属植物，有H. undatus、H. monacanthus和H. megalanthus（Ortiz-Hernández & Carrillo-Salazar， 2012）。通过杂交，目前火龙果品种繁多，黄凤珠等（2019）收集了218份种质资源，也有相关文献报道，在种质资源保存过程中发现，不同品种的火龙果其抗旱和抗病能力差异显著（梁秋玲等，2011;李润唐等，2017）。目前通过RNA-seq技术，可获得大量的转录组序列信息，开展基因表达与功能分析，构建信号通路等。本文对火龙果品种‘普通白肉和‘厄瓜多尔黄龙植株幼嫩茎段组织进行转录组序列从头组装，通过Unigene表达丰度分析、差异表达分析、GO和KEGG富集分析等，从转录组层面阐明火龙果不同品种之间的差异，可为火龙果产业的发展、推广及应用提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

火龙果品种‘普通白肉（BR，以下简称‘白肉）、‘厄瓜多尔黄龙（EY，以下简称‘黄龙）均取自广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所火龙果研究基地（图1），选取标记这两个品种茎段上开始出芽的位置，待其生长7 d，取幼嫩茎段，每个品种设3个生物学重复，采集后立即放入液氮中，交由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行测序。

1.2 文库构建

首先，用带有Oligo（dT）的磁珠富集火龙果样品中的mRNA;然后，将打断的mRNA作为模板，合成二链cDNA;再进行纯化、末端修复、加A尾并连接测序接头;最后，进行PCR扩增，纯化PCR产物，构建文库。待文库检测合格后上机测序，采用Illumina HiSeqTM 2000 PE150对样品转录组文库进行高通量测序。

1.3 De novo拼接和注释

过滤测序得到Raw reads，获得Clean reads。在Trinity软件（Grabherr et al.， 2011）中进行De novo拼接。在NCBI blast中将拼接完成的Unigene与NCBI非冗余蛋白序列数据库、NCBI核酸序列数据库、Swiss-Prot数据库、KOG（clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes）数据库和KEGG（kyotoencyclopedia of genes and genomes）数据库进行比对注释。利用HMMER 3.0 package与Protein family（Pfam）進行比对（hmmscan e-value≤1e-2）。在Blast2go（http：//www.blast2go.com/ b2ghome）软件和WEGO软件中进行GO（gene ontology）注释、分类统计。

1.4 差异基因表达分析

采用DESeq2（Love et al.， 2014）软件进行样品组间的差异表达分析，将差异倍数|log2FoldChange|>1且padj<0.05作为筛选差异表达基因（DEGs）的条件。对符合条件的差异表达基因进行GO Ontology和KEGG Pathway分类，利用超几何检验对注释到的不同的GO（P < 0.05）和KEGG 条目（P < 0.05）进行富集分析。采用FPKM 值（fragments per kilobase of transcriptper million fragments mapped）来展现基因表达水平的高低，在R软件中绘制差异基因表达量的火山图。

2 结果与分析

2.1 转录组测序与组装

为进一步探究不同品种火龙果的分子差异机制，对2个品种火龙果共6个样本进行 RNA-seq分析，获得平均7.71 Gb Clean reads，Q30 均在 90% 以上，总碱基中的GC数量比例为49.06%（表1），表明测序结果良好，Clean reads质量合格，可进行下一步数据分析。

2.2 火龙果转录组Unigene的功能注释

使用BLAST将所有Unigene与NR、GO、KO、Swiss-Prot、PFAM、KOG、NT共7个数据库进行一致性比对分析，对各数据库注释的Unigene数目进行统计，进而获得火龙果转录组Unigene的功能注释信息。结果表明，28 551条Unigene（45.02%）在NR数据库比对成功得到注释，在GO、KO、Swiss-Prot等数据库获得注释的Unigene数目依次为23 082（36.40%）、11 011（17.36%）、21 352（33.67%）（圖2）。4 493条Unigene同时在所有数据库中注释，至少有1个数据库注释成功共34 692条（54.71%），28 714条未获得注释。

2.3 不同火龙果品种差异表达基因分析

对‘白肉和‘黄龙火龙果的差异表达基因进行分析。结果表明，‘白肉和‘黄龙火龙果之间有14 248个差异基因（padj < 0.05且|log2FoldChange|>1）。其中，‘白肉相对于‘黄龙，有5 446个基因上调，表达量高于‘黄龙;有8 802个基因下调，表达量低于‘黄龙（图3）。

2.4 差异表达基因GO功能分类与富集分析

为分析‘白肉与‘黄龙差异基因的生物学功能，将14 248个差异基因注释到GO Ontology数据库中，分别从生物学过程（biological process， BP）、细胞组分（cellular component， CC）和分子功能（molecular function，MF）3个方面，其中：在生物学过程分类中，参与氧化还原过程、碳水化合物代谢过程的差异基因数目最多，分别为632和371个;在细胞组分分类中，主要是被膜等的差异基因组多，有234个;在分子功能分类中，主要是氧化还原酶最多，有618个。

以富集P值小于0.05作为富集标准。在生物过程分类中富集了包括DNA整合、mRNA修饰、mRNA甲基化、有丝分裂、RNA甲基化等39个条目;在细胞组分分类中显著富集了包括肌质、肌质网等28个条目;在分子功能分类中显著富集了包括四吡咯结合、血红素结合、铁离子结合等54项。结果说明，‘白肉与‘黄龙在生长发育、细胞代谢过程等方面存在差异。对上调和下调的差异基因分别进行功能分类，在‘白肉与‘黄龙差异表达基因中满足P值小于0.05的GO条目即为GO功能显著富集，部分结果见图4。对5 446个上调基因进行GO功能分类与富集分析，结果显示，在生物学过程分类中，参与氧化还原过程（oxidation-reduction process）的GO term显著富集，其中包含差异基因341个;在分子功能分类中，参与氧化还原酶活性 （oxidoreductase activity）的GO term显著

A： A. 氧化还原过程; B. 氧化还原酶活性; C. 抗氧化活性; D. 氧化还原酶活性，作用于过氧化物作为受体; E. 铁离子结合; F.  四吡咯结合; G. 血红素结合。B： A. DNA整合; B. mRNA修饰; C.  mRNA甲基化; D.  RNA甲基化; E.  病毒壳体; F.  virion部件; G. RNA定向RNA聚合酶复合物; H.  mRNA甲基转移酶活性; I.  氧裂解酶活性，作用于磷酸盐; J. 萜烯合酶活性; K. ADP结合; L.  RNA甲基转移酶活性; M. 腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶活性; N. RNA定向RNA聚合酶活性。

富集，其中包含差异基因349个，表明‘白肉与‘黄龙在生长发育、细胞代谢过程等方面存在差异;在分子功能分类中，抗氧化活性（antioxidant activity）的GO term富集，表明‘白肉和‘黄龙在抗旱性方面有差异。在下调基因中，主要集中在DNA整合（DNA integration）等方面，差异无显著表现。

2.5 差异表达基因KEGG Pathway 富集分析

‘白肉与‘黄龙共有2 237个差异表达基因注释到特定的KEGG通路中，这些通路主要为新陈代谢、生物合成、糖酵解、信号传导、蛋白质加工等。其中：注释到新陈代谢的差异基因838个，占差异基因总注释数目的37.5%;注释到生物合成的差异基因335个，占差异基因总注释数目的15.0%。以P < 0.05作为筛选显著富集的条件，‘白肉中表达量较‘黄龙上调的差异基因主要富集在生物合成方面，例如角质、木栓质和蜡质生物合成（cutin， suberine and wax biosynthesis）、苯丙素的生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、吲哚生物碱的生物合成（indole alkaloid biosynthesis）等（图5）。其中，参与角质、木栓质和蜡质生物合成的差异基因有12个，分别是HHT1、CYP86B1、CYP86A1、FAR、CYP86A1、HHT1、PXG、CYP86A4S、K15404、CER1 FAR K15404、CER1 K15404、CER1。‘白肉中表达量较‘黄龙下调的差异基因主要富集在生物合成方面，例如类倍半萜和三萜的生物合成（sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis）、精氨酸的生物合成（arginine biosynthesis）、脂肪酸的生物合成（fatty acid biosynthesis）等（图6）。

A.  维生素B6代谢; B.  泛醌和其他萜类醌生物合成; C. 酪氨酸代谢; D.  RNA聚合酶; E.  嘧啶代谢; F. 蛋白酶体; G.  光合作用天线蛋白; H.  光合作用; I.  苯丙素的生物合成; J.  苯丙氨酸代谢; K. 戊糖和葡糖醛酸相互转化; L. 氧化磷酸化; M. 吲哚生物碱生物合成; N.  甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢; O. 半胱氨酸和蛋氨酸代谢; P. 角质、木栓质和蜡质生物合成; Q.  甜菜色素生物合成; R.  抗坏血酸盐和醛酸盐代谢; S.  精氨酸和脯氨酸代谢; T. 氨基糖和核苷酸糖代谢。

3 讨论与结论

高通量测序技术已经成为不同品种差异分析的常用策略，例如烟草（李智奕，2014）、大豆（张驰等，2015）、桂花（张雪松等，2016）、百香果（王宇等，2019）等。本研究利用RNA-seq技术对火龙果不同品种进行转录组学分析，基于良好的测序结果，进一步对‘白肉与‘黄龙火龙果的差异表达基因进行分析，发现共有14 248个差异表达基因，通过GO Ontology分析表明这些差异表达基因主要富集在新陈代谢、生物合成、糖酵解、信號传导、蛋白质加工等过程，说明‘黄龙可能在生长发育、抗性方面与‘白肉有差异。在分子功能分类中，与‘黄龙相比，‘白肉火龙果上调表达的基因中参与氧化还原酶活性的差异基因有349个，表明‘白肉与‘黄龙在生长发育、细胞代谢过程差异显著，‘白肉比‘黄龙的生长发育更快，代谢更加旺盛，与实际栽培种植过程中的现象相符。‘白肉表现出比‘黄龙更快的生长速度，在一年中结果的批次、果实的发育都有差异，‘白肉一年结果大概8批，从授粉到成熟需要28～30 d，‘黄龙一年结果2批，夏果和冬果，成熟期需要90～120 d。在分子功能分类中，两者抗氧化活性差异显著，表明‘白肉和‘黄龙在抗旱性方面有差异。为了在干旱环境中生存，仙人掌科植物必须具备干旱反应机制，特别是抗氧化防御系统。持续的干旱胁迫会导致氧化性物质，如O2、H2O2、O2-、OH的积累，这些物质会损害细胞，甚至导致死亡（Fang & Xiong， 2015），这些抗氧化活性基因在‘白肉中富集，上调表达，可能使得‘白肉抗干旱能力强于‘黄龙。

在KEGG Pathway中以P < 0.05作为富集条件，在‘白肉上调表达的基因中，主要富集在角质、木栓质和蜡质生物合成，其中参与角质、木栓质和蜡质生物合成的差异基因有12个，主要代表有CYP86和CER1。植物蜡质是植物在进化过程中为了适应环境的变化而演变出来的一种结构，表皮蜡质在植物抵御外界不良环境、保持组织和器官功能、保证植物正常发育等方面具有重要作用（李魏强等，2006;胡晓敏等，2007;任春涛等，2019）。上表皮蜡沉积的主要功能是减少表皮的水分流失，这一特性有助于增强耐旱能力。此外，在与草食性昆虫和植物病原真菌的相互作用中具有重要作用（Aarts et al.， 1995），蜡质层在一定程度上可使植物免受低温胁迫作用（李婧婧等，2011）。其中，12个关键基因参与角质、亚黄素和蜡的生物合成，如CYP86编码ω-基脂肪酸的形成，促进软木脂生物合成，形成角质层。这些脂肪类生物聚合物可防止植物水分和营养流失以及病原体的感染（Aarts et al.， 1995; Hofer et al.， 2008）。CER1编码参与长链醛转化为烷烃的蛋白，这是植物体中蜡生物合成的关键步骤（Hofer et al.， 2008）。本研究对这些关键调控基因分析发现，此类基因在‘白肉中具有较高的表达量，这些可能与植物的抗旱和抗病有关。

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（责任编辑 李 莉）

基金项目：  国家重点研发计划项目（2019YFC0507503，2019YFC0507504-03）;广西创新驱动发展专项资金（桂科AA2016100403-01）;广西自然科学基金（2019GXNSFBA245097）;广西喀斯特植物保育与恢复生态学重点实验室基金（19-050-6）  [Supported by National Key Research and Development Program （2019YFC0507503， 2019YFC0507504-03）;Innovation-Driven Development Special Fund of Guangxi （AA2016100403-01）;Natural Science Foundation of Guangxi （2019GXNSFBA245097）;Fund of Guangxi Key Laboratory of Plant Conservation and Restoration Ecology in Karst Terrain （19-050-6）]。

第一作者： 李健星（1992-），硕士，助理研究员，主要从事植被生态学研究，（E-mail）jxlee140820@163.com。

*通信作者：  陆树华，副研究员，主要从事恢复生态学研究，（E-mail）lushuhua13@163.com。