战骨黄酮碳苷类化合物的大孔树脂富集工艺研究

党骄阳 陈月圆 颜小捷 卢凤来 李霞 李典鹏

摘 要：  黃酮碳苷，作为战骨植物中的有效成分之一，具有抗骨关节炎的功效。为优化植物战骨茎中总黄酮碳苷的富集纯化工艺，该研究以战骨中5个黄酮碳苷为考察指标，通过对13种大孔树脂的静态吸附与解吸实验，优选出合适的大孔树脂，利用高效液相色谱对结果进行检测，然后利用正交工艺优化富集纯化条件。结果表明：（1）XAD-16N型大孔树脂对植物战骨茎中黄酮碳苷具有较好的吸附和解吸效果，通过单因素筛选及正交工艺优化，最终确定其最佳富集纯化工艺为上样浓度为原提取液稀释2倍、上样流速2 BV·h-1、洗脱液浓度60%乙醇。（2）总黄酮碳苷的含量由1.73%（原植物中含量）提高到14.50%，提高了7.38倍。以上结果表明，优化的提取工艺稳定可行，筛选的大孔树脂富集纯化效果良好，为植物战骨茎的药物开发提供数据参考。

关键词： 战骨， 黄酮碳苷， 大孔树脂， 正交试验

中图分类号：  Q946

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2022）02-0333-07

Purification technology of total flavonoid-C-glycosides

of Premna fulva by macroporous resin

DANG Jiaoyang1，2， CHEN Yueyuan2， YAN Xiaojie2， LU Fenglai2， LI Xia1， LI Dianpeng2*

（ 1. College of Chemistry and Bioengineering， Guilin University of Technology， Guilin 541006， Guangxi， China;  2. Guangxi Key Laboratory of

Functional Phytochemicals Research and Utilization， Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China ）

Abstract：  Flavonoid-C-glycosides， as one kind of the effective components in Premna fulva， have the effect of antigen-induced arthritis. In order to optimize the enrichment and purification process of  P. fulva stems， through static adsorption and desorption experiments on 13 kinds of macroporous resins with five flavonoid-C-glycosides in P. fulva stems as the index， a suitable macroporous resin was selected， and the results were tested by the HPLC， and then the orthogonal process was used to optimize the enrichment and purification conditions. The results were as follows： （1） XAD-16N macroporous resin has good adsorption and desorption effects on the five flavonoid -C-glycosides in P. fulva stems. Through single factor screening and orthogonal process optimization， the best enrichment and purification process was finally determined as that the loading concentration was two times the original extract diluted， the loading flow rate was 2 BV·h-1， and the eluent concentration was 60% ethanol. （2） The contents of five flavonoid-C-glycosides increased from 1.73% （in the original plant） to 14.50%， an increase of 7.38 times. All the results indicate that the selected extraction process is stable and feasible， and the selected macroporous resin has good separation and purification effects， which provides a reference for the drug development of P. fulva stems.

Key words： Premna fulva， flavonoid-C-glycosides， macroporous resin， orthogonal test

战骨又名黄毛豆腐柴（Premna fulva），马鞭草科豆腐柴属植物，其根、茎、叶均可以入药。分布于广西南宁、龙州平果等地（戴春燕等，2007;史艳财等，2010）。具有祛风止痛等功效，民间常用于治疗腰腿疼痛、跌打扭伤、风湿性和类风湿性关节炎等，是广西的地道药材（蒋才武等，2004）。战骨作为广西道地药材，药用历史悠久。文献调研发现对战骨的研究主要集中在化学成分（潘洪平，2002;吴雪莉等，2016）、药理（叶勇等，2018）及相关制剂的药效、临床研究（陈苍海，2018）等方面。方刚（2018）明确战骨的主要成分为柚皮素等黄酮类化合物，并对黄酮类成分研究进行了提取工艺研究（李小燕等，2005）。最新研究发现，以战骨为原料的单方制剂产品健骨注射液的抗骨关节炎的功效成分主要为5个黄酮碳苷（Chen et al.，2019）。且梁玉婷等（2018）报道基于UFLC-Triple TOF-MS/MS技术，从战骨植物中指认出18个黄酮碳苷类化合物异构体，说明战骨植物中含有丰富的碳苷黄酮。战骨中黄酮碳苷的提取采用天然低共熔溶剂（NADESs）可高效提取黄酮碳苷（陈月圆等，2020），总黄酮碳苷实际得率为17.37 mg·g-1，显著高于现有传统有机溶剂提取工艺（13.70 mg·g-1），但是，该黄酮碳苷类提取物中仍普遍含有萜类、多糖、蛋白质、木脂素等多种杂质，严重制约了黄酮碳苷类化合物的实际应用。因此，非常有必要开发出一种有效的方法用以生产高纯度的战骨黄酮碳苷类化合物。本文建立了富集战骨中黄酮碳苷类化合物的纯化方法，黄酮碳苷类化合物作为战骨植物中的主要功效成分，为了进一步开发和利用战骨中的黄酮碳苷类化合物，及现有产品制剂（如健骨注射液）的二次开发和利用。

大孔树脂作为一种有机高聚物吸附剂，具有吸附性好、选择性强、吸附速度快、可重复利用的特点，已广泛应用于黄酮类成分的分离纯化以及化学医药等领域（汪洪武和刘艳清，2005;刘丹等，2016）。战骨黄酮碳苷的NADESs提取液能否运用大孔树脂富集纯化研究未见报道，故本文采用大孔树脂法对战骨植物中的5个黄酮碳苷的NADESs提取液进行富集纯化研究。通过比较13种大孔树脂对战骨植物中5个总黄酮碳苷的吸附效率，筛选出了一种对战骨具有高吸附分离效率的树脂，通过单因素实验及正交试验对该树脂的工艺条件进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料和实验仪器

战骨购于广西玉林药材市场，经广西植物研究所唐辉研究员鉴定为马鞭草科豆腐柴属植物黄毛豆腐柴（Premna fulva）的根茎。凭证样品保存于广西植物功能物质研究与利用重点实验室。

5个黄酮碳苷对照品（芹菜素-6，8-二-C-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-半乳糖苷、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷和芹菜素-6-C-β-D-半乳糖-8-C-β-D-木糖苷），实验室自制，纯度大于95%;大孔树脂HPD-750、HPD-BJQH、HPD-100、D296、LSA-700B、LX-T5、NKA、XAD-16N，赛普锐斯（北京）科技有限公司;FPA53，北京慧德易科技有限公司;LX-38、LX-T28、LX-60，西安蓝晓科技新材料股份有限公司;D101，沧州宝恩吸附材料科技有限公司;氯化胆碱，郑州超凡化工有限公司;1，3-丙二醇，山东绿健生物技术有限公司;甲醇为色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司;娃哈哈饮用纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司。

岛津LC-2030C型液相色谱仪，岛津企业管理（中国）有限公司;JP-040型数控超声波清洗器，深圳市洁盟清洗设备有限公司;LQ-A10002型电子天平，瑞安市安特称重设备有限公司;N-1300旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品的制备 将战骨的茎磨成粉末，用40%乙醇浸泡两周，将提取液浓缩后，经大孔树脂、C18、MCI等柱材料分离划段，得到富含5个黄酮碳苷的部位，最后按照Chen等（2019）的方法，采用循环高速逆流色谱法成功得到5个黄酮碳苷对照品。

1.2.2 战骨NADESs提取液的制备 根据课题组前期优化的战骨绿色提取溶剂天然深共晶溶剂（NADESs）的提取工藝（陈月圆等，2020），取干燥的战骨粉末适量过筛（80目），按照专利的方法提取战骨茎总黄酮碳苷，收集上清液，备用。

1.2.3 色谱条件及对照品溶液的配制 色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）;柱温为30 ℃;流动相0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）;梯度洗脱程序为0～20 min、10%～30%B，20～45 min、30%～40%B;流速为1.0 mL·min-1;检测波长为280 nm;进样量为20 μL。

标准溶液的配置：分别精确称取一定质量的5个对照品7.6、5.1、7.2、5.7、2.8 mg，用无水乙醇在10 mL的容量瓶中定容，制成浓度为0.760、0.516、0.726、0.576、0.286 mg·mL-1的贮备液，分别将5个贮备液稀释一定的倍数，取5、10、15、20 μL进行液相分析。

1.2.4 标准曲线的建立 采用外标法定量，以色谱峰面积（Y）为纵坐标，对照品浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，进行线性回归分析，得到标准曲线回归方程。将最低浓度标准工作溶液重复进样 10 次，计算标准偏差，分别以3倍和10倍标准偏差为方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果见表1。可以看出，方法的线性良好，且灵敏度较高。

1.2.5 大孔树脂的选择

1.2.5.1 大孔树脂的预处理 分别称取一定量HPD-750、HPD-BJQ、HPD-100、D296、LSA-700B、LX-T5、NKA、XAD-16N、FPA53、LX-38、LX-T28、LX-60和D101共13种大孔树脂，用乙醇浸泡24 h，用蒸馏水反复清洗至无味，备用。

1.2.5.2 静态吸附性能 选择上述预处理好的大孔树脂各50 g，分别置于500 mL锥形瓶中，各加入250 mL的提取液，25 ℃下恒温恒速振荡吸附24 h，抽滤，每组做3个平行实验，取滤液测定5个黄酮碳苷的总质量。然后用去离子水清洗3次树脂，用滤纸将树脂表面的水分吸干，转入500 mL锥形瓶中，加入80%的乙醇250 mL，于25 ℃下恒溫恒速振荡解吸12 h，取上清液测定5个总黄酮的总质量，按照下列公式计算吸附率与解吸率，比较静态吸附性能，从13种树脂中筛出吸附性能最佳的树脂。

吸附率（%）=（原液中5个黄酮碳苷总质量-吸附后滤液中5个黄酮碳苷总质量）/原液5个黄酮碳苷总质量×100;

解吸率（%）=解吸后溶液中5个黄酮碳苷的总质量/树脂吸附的5个黄酮碳苷总质量×100。

1.2.6 泄露曲线的绘制 根据1.2.5.2的筛选结果，将大孔树脂预处理好后，湿法装样，取提取液原液上柱，每份60 mL，以固定的流速进行动态吸附，分别接出每一份流出液，测出流出液中5个黄酮碳苷的含量，绘制泄露曲线。

1.2.7 单因素实验及正交优化试验 按照1.2.2提取液的制备方法，制备提取液。以吸附率和解吸率作为综合考查的指标，在其他因素相同的情况下，分别考查提取液上样浓度[原提取液稀释1倍、稀释2倍、原液（0倍）]、上样流速（1、2、3 BV·h-1）、洗脱液浓度（50%、60%、70%乙醇）、洗脱液用量（1、2、3 BV）对吸附率和解吸率的影响。

根据单因素实验的筛选结果，从提取液上样浓度、上样速度、洗脱液浓度、洗脱液用量中筛选出上样浓度、上样流速、洗脱液浓度3个影响较大的因素为自变量，考察战骨中5个主要活性黄酮碳苷在树脂中的总解吸率及在洗脱液中的含量为指标，设计L9组（34）正交试验，正交试验因素与水平见表2。总解吸率及含量按照下式计算。

解吸率（%）=洗脱液中5个活性黄酮碳苷的总质量/原液中5个黄酮碳苷总质量在树脂中的总吸附质量×100;

含量（%）=洗脱液中总黄酮碳苷的质量洗脱液总质量×100。

2 结果与分析

2.1 树脂静态吸附性能比较

静态吸附结果（图1）表明：战骨5个黄酮碳苷的静态吸附率较优的树脂为XAD-16N（86.65%）、LX-60（83.51%）、LX-T28（81.92%），树脂间差异性不显著（P>0.05）。D296和LSA-700B对战骨5个黄酮碳苷的静态吸附率也较好（81.71%，82.00%），但是两者的解吸率只有1.44%、1.03%，其原因是这两类树脂为脱色型树脂，其吸附量用酸和碱均无法将其洗脱。而LX-T5、FPA53两个树脂吸附性能和解吸性能相对都比较差，吸附率和解吸率都比较低。尤为重要的是，与现有战骨制剂健骨注射液工业处理的树脂D101相比（王静宇和杜日建，2014），XAD-16N、LX-60、LX-T28三种树脂吸附率均显著优于D101（74.30%），而4种树脂在静态解吸率上均无显著差异。故又采用动态吸附和解吸考察此4种树脂的泄露曲线。

2.2 吸附泄露曲线

分别绘制XAD-16N、LX-T28、LX-60、D101大孔树脂的泄露曲线，由图2可知，随着上样量的增加，5个黄酮碳苷的泄漏量逐渐增加，当份数增大到动态饱和吸附时，泄露量增加的趋势明显上升，即大孔树脂达到动态饱和吸附。不同树脂对战骨植物5个黄酮碳苷的吸附量有所差异，泄漏量也有所不同。其中，XAD-16N的泄漏量最少吸附量最多，其次是D101，接着是LX-T28，而LX-60树脂的吸附量最低，因此选用XAD-16N做动态吸附实验。

2.3 战骨黄酮碳苷优化工艺

2.3.1 提取液上样浓度 上柱液浓度分别为原提取液稀释1倍、稀释2倍、原液（0倍），每份100 mL，分别以2 BV·h-1（每小时2倍柱体积）的流速通过XAD-16N型大孔树脂，用纯水洗脱至流出液为无色，收集过柱液，用70%乙醇洗脱3 BV，收集洗脱液。每组实验做3个平行，按2.2方法测定5个黄酮碳苷的总含量，计算5个黄酮碳苷的总吸附率和总解吸率。从表3可以看出，原液稀释1倍与原液稀释2倍两者的吸附率都是100%，但使用原液上样时，吸附率却只有67.32%;而解吸率原液和原液稀释1倍差异性并不显著，原液稀释2倍最小，综上考虑，故确定上样浓度为原液稀释1倍。

2.3.2 上样速度 根据2.3.1的筛选结果，固定上柱液浓度（原液稀释1倍），如表4所示，不同的上样流速对战骨植物总黄酮在XAD-16N型大孔树脂中吸附率和解吸率存在影响，上样流速为1、2 BV·h-1时吸附率一样，3 BV·h-1时吸附率显著下降，而解吸率随着上样流速的增大逐渐变小，综合考虑确定上样流速为1 BV·h-1。

2.3.3 洗脱液浓度 取浓度为原液稀释1倍上柱液的4份，每份100 mL，以1 BV·h-1的流速通过XAD-16N型大孔树脂，用纯水洗脱至流出液为无色，收集过柱液，分别用50%、60%、70%、80%的乙醇洗脱3 BV，收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的含量。从表5可以看出4个浓度下的吸附率都一样，但解吸率随着浓度的增加逐渐增大，当洗脱液浓度为70%与80%时，解吸率差异并不显著。因此，从节约溶剂的角度考虑，最终确定洗脱液的浓度为70%。

2.3.4 洗脱液用量 按照经单因素考察后2.3.3的方法，饱和吸附后，用纯水洗脱至流出液为无色，分别用70%的乙醇溶液洗脱1、2、3、4 BV，收集洗脱液。每组实验做3个平行，按1.2.7测定和计算5个黄酮碳苷的总含量，并计算5个黄酮碳苷的总吸附率和总解吸率。从表6可以看出，洗脱液用量为1 BV的时候解吸率最小，只有81.24%;随着洗脱液体积的增大，解吸率逐渐增大，当洗脱液用量为4 BV时，解吸率达到最大，为98.61%。这说明少体积洗脱液并不能将黄酮碳苷全部洗脱，而洗脱液用量为3 BV时解吸率为95.92%，与4 BV相差不大，从节约溶剂的角度考虑，最终确定洗脱液用量为3 BV。

2.3.5 正交试验 根据单因素实验的结果，按照表2的正交试验设计，试验结果见表7。由极差分析结果可知，树脂XAD-16N影响纯化战骨植物中5个黄酮碳苷的工艺因素依次为B > C >A， 即上样流速>洗脱液浓度 >上样浓度。由表8的方差分析结果可知，因素A、B、C均无显著影响（P>0.05）。战骨植物中5个黄酮碳苷提取理论最优水平为A2、B2、C2，即上样浓度为原液稀释2倍、上样流速2 BV·h-1、洗脱液浓度60%乙醇。

2.4 验证试验

采用2.3.5最优工艺进行3次验证试验，结果见表9。由表9可知，5个总黄酮碳苷的含量为14.50%，而由原植物提取液中5个总黄酮碳苷的含量为1.73%，实验结果确证筛选得到的大孔树脂XAD-16N富集纯化效果良好。

3 讨论与结论

大孔树脂具有高交联度和多永久性孔隙的特性，广被用于黄酮类化合物的分离和提纯。大孔树脂能从植物提取物中分离黄酮类化合物的优势是由于黄酮类化合物本身的特性，因为它们的苷元上有苯环和几个氢基，有助于具有适当的平均孔径、极性和表面积的大孔吸附树脂吸附这些化合物。结果表明，XAD-16N作为理想树脂用于战骨中黄酮碳苷提取液（天然深共晶溶剂作为提取媒介）的富集纯化的吸附和解吸能力最强，说明大孔树脂的大孔径（560～710 μm）、大比表面积（800 m2·g-1）和苯乙烯系基质最适合于战骨提取物中黄酮碳苷的吸附和释放。故战骨提取物大极性的黄酮碳苷与大极性树脂之间的极性匹配主要归因于氢键和范德华相互作用。

乙醇是一种有机溶剂，具有可回收、价格低廉、毒性低且对人类无安全威胁等优点。因此，本研究选择它作为脱附剂。实验结果表明，黄酮碳苷类化合物的解吸率与乙醇浓度成正比，这意味着随着解吸率的增加，乙醇浓度也会增加。达到峰值后，解吸率随乙醇浓度的进一步增加而趋于平缓。吸附在树脂上的分子间作用力与溶解在溶剂中的分子间相互作用对黄酮碳苷类化合物从树脂上的解吸具有重要作用。而且，XAD-16N成功地富集了战骨中存在的黄酮碳苷类化合物，并能选择性地吸附黄酮碳苷类化合物。与传统的纯化工艺（D101）相比，树脂XAD-16N的吸附率（86.65%）和解吸率（86.54%），均显著优于D101（吸附率74.30%，解吸率77.21%）。本研究通过单因素筛选及正交工艺优化，最终确定其最佳富集纯化工艺为上样浓度为原提取液稀释2倍、上样流速2 BV·h-1、洗脱液为60%乙醇。总黄酮碳苷的含量由1.73%（原植物中含量）提高到14.50%，提高了7.38倍。因此，本研究开发了一种简单有效的从战骨植物中提取黄酮碳苷的方法。该方法操作简单，回收率高，工艺稳定可行，可为今后战骨工业大批量生产提供一定的参考价值。

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（责任编辑 李 莉）

收稿日期：  2020-12-02

基金项目：  广西创新驱动发展专项（桂科AA18118015）;广西自然科学基金（2018GXNSFAA294031）;中央引导地方科技发展专项（桂科ZY20111010） [Supported by Innovation-Driven Development Special Project of Guangxi（AA18118015）; Natural Science Foundation of Guangxi（2018GXNSFAA294031）; Special Project of Local Science and Technology Development Guided by the Central Government （ZY20111010）]。

第一作者： 黨骄阳（1996-），硕士研究生，研究方向为药物研发与转化，（E-mail）545121289@qq.com。

*通信作者：  李典鹏，博士，研究员，主要从事植物化学研究，（E-mail）ldp@gxib.cn。

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