亳菊加工过程中关键酶活性和黄酮类成分相关性研究

左亚锋 王娜 王孟虎 汤建 吴德玲 张伟

摘 要：目的：研究亳菊模拟加工过程中关键酶活性变化对黄酮类成分的影响以及两者之间的内在联系。方法：采用pNPG法测定不同温度温度下不同时间点加工的亳菊样品中酶活性;同时采用HPLC测定40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃ 6个温度不同时间点加工的亳菊样品中6种黄酮类成分的含量。通过酶活性大小测定和化学成分含量变化来研究兩者之间的相关性及加工温度对亳菊质量的内在影响。结果：发现亳菊细胞内关键酶活性在低温下（<80℃）保存时间较长，在高温状态下（≥80℃），酶活性下降较快，90℃下酶在15min内基本失活。同时我们发现亳菊中黄酮苷类成分在不同温度下随着加热时间延长，黄酮苷类成分含量变化跟酶活性有密切的相关性。当新鲜亳菊在低温下（<80℃）加热时，关键酶酶活性在亳菊细胞内保存时间较长，酶活性越高，黄酮苷类成分降低越明显，随着时间增加，酶活性在细胞内稳定性降低但仍有酶活性，黄酮苷类成分逐渐降低;当新鲜亳菊在高温下加热时，由于温度在新鲜亳菊内是渐进式增大的，细胞体内酶活性在15min内基本都有活性，所以在15min内黄酮苷类成分是逐渐降低，随着加热时间增加，细胞体内达到高温状态，酶逐渐失活，无法水解黄酮苷类成分，黄酮苷类成分保持稳定。在实验过程中，黄酮苷元（金合欢素）含量升高，木犀草素含量升高不显著，芹菜素含量降低。结论：亳菊中黄酮类化合物含量变化和亳菊细胞内关键酶活性变化有密切的相关性，通过调控亳菊加工过程中的温度可以影响亳菊细胞内关键酶活性进而影响其黄酮类成分含量的变化。而黄酮苷元（金合欢素）含量升高，木犀草素含量升高不明显，芹菜素含量降低，推测是因其结构性质易形成配合物及加热激活褐变酶的酶活性使其氧化聚合而含量降低，其反应机理有待进一步验证。通过实验研究，我们确定了温度对酶活性和黄酮类成分的影响及其相关性，这为我们规范亳菊加工，保障亳菊品质提供研究基础。

关键词：亳菊;酶活性;干燥;相关性;黄酮类成分

中图分类号：O656.4  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2022）02-0068-04

菊花为菊科植物菊的干燥头状花序[1]，药典收载的五种药用菊花因产地和加工方法的不同分为“亳菊”“滁菊”“贡菊”“杭菊”“怀菊”。五种药用菊花加工方式差异较大，其中亳菊的传统加工方式为阴干[2]，但是随着市场对亳菊需求量的增加，这种传统方式已经无法适应产地大规模生产需求，市场调研发现亳菊目前产地加工主要方式为烘干。相关文献报道发现，不同加工方式的亳菊中化学成分含量差异较大，这其内在品质会有一定影响[3-6]，课题组前期研究[7-9]表明亳菊在加工过程中黄酮类成分含量变化主要机理就是加热激活亳菊细胞内关键酶酶活性，酶水解黄酮苷生成黄酮苷元从而对亳菊品质产生影响。但是温度如何影响酶活性以及酶活性和黄酮类成分之间的相关性并没有见报道，因此本文对亳菊模拟加工过程中温度对酶活性和黄酮类成分的影响及其相关性进行研究，期待为新鲜亳菊产后规范加工提供研究基础。

1 仪器和材料

Waters1525型高效液相色谱系统（厂家）;XS3DU分析天平（厂家梅特勒-托利多）;FA2104N电子天平（上海菁海仪器有限公司）;DGT-G70电热鼓风恒温干燥箱（合肥华德利科学器材有限公司）;JK-250DB型数控超声清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）;Heraeus Multifuge X1R低温离心机（美国赛默飞公司）;85-2控温磁力搅拌器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）;UV-759CRT紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）。

对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（合肥博美生物科技有限公司）;柠檬酸，柠檬酸铵，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，石英砂均购自天津永大化学试剂有限公司;木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品（批号CFN98565，纯度≥98%）;木犀草素对照品（批号CFN98784，纯度≥98%）;芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品（批号CFN98981，纯度≥98%）均购自武汉天植生物有限公司;芹菜素对照品（111901-201603，纯度99.2%）;绿原酸对照品（110753-201817，纯度96.8%）;3，5-二咖啡酰奎宁酸（111782-201807，纯度94.3%）均购自中国食品药品检定研究院;金合欢素（自制，归一化度≥98%）;金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷（自制，归一化度≥98%）。亳菊：采自亳州亳菊药材基地，由闫攀鉴定为菊科植物亳菊Dendranthema morifolium（Ramat.） Tzvel.‘Boju’cv.nov.的头状花序。磷酸（南京化学试剂股份有限公司，分析纯）;甲醇（天津市永大化学试剂有限公司，分析纯）;乙腈（迈达科技股份有限公司，色谱纯）;水为纯净水。

2 方法

2.1 亳菊模拟加热样品制备

取新鲜亳菊5g，精密称定，放入托盘中，置于不同温度的干燥箱中模拟加热，设定40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃六个温度点，分别在1min、5min、10min、15min、30min、45min、60min、90min、120 min、240min、360min时取样。

2.2 关键酶活性测定[7，8]

2.2.1 关键酶提取

取不同温度不同时间点下加热的亳菊，置于榨汁机中，加入少量石英沙和5%的甘油，再加入适量预冷的100mmol/L柠檬酸缓冲液（pH 4.0），榨汁1min成匀浆后于低温下缓慢搅拌1h后抽滤。抽滤液转移到离心管中，放置于低温冷冻离心机中，12000r/min离心20min，取上清液作为粗酶液。

2.2.2 关键酶酶活性测定

在试管中加入0.2mL pNPG，0.6mL柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液（pH4.0）和0.2mL酶液，在50℃水浴条件下反应45min。反应结束后，向反应体系中加入2.5mL 1mol/L的Na2CO3终止反应，在400nm波长下测定其吸光度值。

2.3 含量测定[6]

2.3.1 对照品溶液的制备

分别精密称取对照品绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金合欢素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和芹菜素适量至5mL容量瓶中，用70%甲醇定容，制成每毫升含有绿原酸1.02mg、3，5-二咖啡酰奎宁酸1.236mg、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷0.752mg、木犀草素1.052mg、金合欢-7-O-β-D-葡萄糖苷0.608mg、金合欢素1.062mg、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷1.102mg和芹菜素1.032mg的对照品溶液，4℃保存备用。

2.3.2 供试液的制备

取不同温度和时间下加热亳菊鲜花约5g，精密称定，精密加入70%甲醇50mL至具塞锥形瓶，称定重量，超声处理（功率500W，频率45kHz），40min，放冷，再称定重量，用70%的甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm滤膜滤过，取续滤液即得。

2.3.3 HPLC条件

Agilent HC-C18（2）柱（4.6mm×250mm，5μm）;流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），线性梯度洗脱（0～8min，12%～17%A;8～25min，17%～19%A;25～30min，19%～19%A;30～60min，19%～52%A;60～65min，52%～12%A）;流速为1.0mL/min;柱温为30℃;检测波长为330nm，进样体积20μL。

3 结果与讨论

3.1 新鲜亳菊加工过程中关键酶活性变化规律

由图1可知，关键酶在亳菊细胞内热稳定性较好，亳菊在40℃及50℃状态下加热2h，关键酶酶活性仍很高，加热超过6h才基本失去活性。随温度升高酶稳定性逐渐下降，当加热温度为60℃时，加热2h酶活性就很微弱，当加热温度超过70℃时，酶活性会急剧下降，加热45min基本失活。在温度为90℃时，酶在10min内即基本失活。

本实验研究的是亳菊细胞内关键酶热稳定性，与课题组前期研究[6，8]提取纯化得到的亳菊酶液进行的性质研究相比较，得到的规律基本相同。这说明关键酶在复杂的细胞内体系中和单一的细胞外体系内性质差别不大，将该酶纯化后进行性质研究所得的结果可以适用于原药材的复杂体系内。

3.2 新鲜亳菊模擬加工过程中主要成份含量变化规律

由图2-4可知，加热温度对亳菊黄酮类成分影响较大。通过比较发现，在低温状态下，酶活性较大，酶活性保存时间较长。随着加热时间增加，酶活性稳定性逐渐降低但仍有酶活性。在此期间对应的黄酮苷类成分因关键酶的水解逐渐降低直至消失。在高温状态下，由于温度在亳菊细胞内是渐进式升高，酶活性并没有直接被灭活，15min内保持基本酶活性，在此期间黄酮苷类成分是逐渐降低的。高温状态下随着加热时间增长，亳菊细胞内也达到高温状态，关键酶酶活性基本消失，此后时间段黄酮苷类成分基本保持稳定。由图2-4也可知，亳菊干燥状态下（干燥2h，4h，6h），黄酮苷类成分含量在高温状态下要比低温状态下高，这是因亳菊干燥2h，4h，6h后，高温灭活关键酶酶活性，使其不能水解黄酮苷生成黄酮苷元。但是黄酮苷元中木犀草素和芹菜素的含量随着加热时间的延长并没有显著的升高，这可能跟其结构性质及亳菊中存在的褐变酶有一定关系。亳菊中的褐变酶主要有多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）等，这些酶的存在会作用于亳菊中的酚类、黄酮类成分，使其发生氧化和聚合反应导致组织褐变，甚至腐败变质，严重影响亳菊品质和质量[10]。目前国内有学者对亳菊褐变酶[11]和硫熏剂量对亳菊褐变酶和化学成分的影响[12]进行了报道，结果表明亳菊采收加工中酚类等成分变化的主要因素可能就是褐变酶被激活。因此我们推测亳菊加热过程中在低温状态下褐变酶被激活，这两种黄酮苷元被褐变酶氧化聚合而含量降低。当温度升高时，由于褐变酶在新鲜亳菊组织体内，而温度升高在新鲜亳菊组织内部是渐进式的，这就导致褐变酶在高温状态下是先被激活后被抑制，仍然会产生作用。黄酮类化合物大多数为强的金属螯合剂[13]，熊运浩[14]对木犀草素-金属配合物的制备进行了研究，并在中药水煎液中发现木犀草素与金属微量元素形成的配合物，蔡胜[15]，楚婧[16]，丁桂峰[17]，夏小明[18]等分别对木犀草素-金属配合物的制备进行了研究，孙秀琴等[19]综述了芹菜素和铁、芹菜素和铜的螯合作用，结果表明木犀草素、芹菜素与金属离子有较强的配位能力，木犀草素、芹菜素与金属离子形式配合物也是影响其含量的一种因素。

4 讨论

亳菊在加工过程中温度的选择会对亳菊质量产生很大影响。亳菊中由于存在关键酶，在一定温度下会激活关键酶水解黄酮产生黄酮苷元。加工过程中温度不同，导致关键酶活性不同，从对酶水解黄酮产生黄酮苷元影响，最终加工得到的亳菊品质差异很大。因此，在亳菊规范加工过程中应充分考虑温度对关键酶活性和黄酮类成分的影响，根据其相关性选择合适温度的加工方法。亳菊中也存在褐变酶，推测该酶在加工过程中由于温度的影响也会对黄酮苷元含量产生影响，具体影响及其基质还需要我们进一步研究。因此，在亳菊的加工过程中不仅要考虑到温度变化对关键酶的影响，也要考虑亳菊中存在的褐变酶，规范亳菊加工工艺，保证亳菊质量。

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收稿日期：2021-09-27

通讯作者：张伟（1985-），男（汉族），硕士，副教授，研究方向：中药炮制及中药药效物质基础。

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81973485）;国家自然科学基金青年科学基金项目（81303229）;安徽高校自然科学研究重点项目（KJ2020A0765）;中药原料产品研发安徽普通高校重点实验室（亳州学院）（KLAHEI18032）;亳州学院校级科研项目（BY2017C04）

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