常用中药材鉴别方法的研究进展*

李春华，陶静雨，李玉虹，赵 燕，王京贤，王 婷，闫玉鑫

(云南师范大学 职业技术教育学院应用化学系，云南 昆明 650092)

中药主要来源于天然药及其加工品，包括植物药、动物药、矿物药及部分化学、生物制品类药物。我国中药应用历史悠久，资源丰富，种类繁多，来源复杂，品种易混淆，存在问题颇多，如一药多种来源，本末难分;形态相似的药材，可能造成误收、误用等。近年来，在经济利益驱使下，加上我国中药种类繁多，且各自形态特征差异不明显，时常发现以次充好、以假充真的现象，使得准确鉴定药材困难，容易导致市场用药品种混乱。2020年，国家药品抽检在全国范围内共抽取8个中药饮片品种，分别为：广藿香、制川乌、巴戟天、秦艽、射干、前胡、红景天和黄精。总共1368批次检验样品，其中不合格样品30批，不合格率为2.19%;其中，性状项不符合规定的有23批(1.68%)，薄层鉴别项不符合规定的4批(0.29%)[1]。董丽荣等[2]对昆明市近5年内中药饮片及中药材的抽验，共抽验中药材及饮片1556批，不合格152批次，其中有58批性状不合格，39批鉴别项不合格，60批有含量测定不合格。如果不能正确鉴别中药，将直接影响到临床用药的准确性与安全性，轻则造成资源浪费，重则产生毒副作用，甚至威胁人的生命。因此开展中药的品种评价，研究制定中药的鉴别依据和质量标准，使中药标准化、规范化，确保临床用药的安全有效。中药鉴别主要是通过对中药材的外观、品质、性状、组织结构、内部成分等进行鉴别以确定中药材的真伪和优劣。本文将分别从性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别以及分子鉴别四种鉴别方法对常用中药材的鉴别研究进展综述如下。

1 性状鉴别

1.1 传统性状鉴别

性状鉴别，是通过眼睛观看、手触摸、鼻子闻、口尝味、水试、火试等十分简便的鉴别方法，对生物的性质、外观形状、颜色光泽、表面特征、断面、质地、气、味等作为依据对中药进行真实性鉴别[3]。此方法具有简单易行、方便迅速等优点，是常用而且行之有效的鉴别方法之一。

张宗良[4]根据中药材的外观性状、科属种别等方面特征，对几种容易混淆的中药如金银花和山银花、半夏和水半夏、鸡血藤和大血藤等的形状鉴别要点进行归纳总结，以为临床安全使用中药材提供参考。张燕等[5]对冬虫夏草、西红花、阿胶三种名贵药材及其伪品，从来源、形状、大小、表面特征等多个方面进行性状鉴别和分析，为中药材的鉴别分析奠定理论和实践基础。冯菲[6]运用丰富的工作经验，选取威灵仙、天麻、杜仲、苏木等10种中药材，总结对其进行快速经验鉴别的方法，为中药鉴别提供理论和实践指导。

1.2 仿生技术性状鉴别

仿生技术是一种在不损伤药材、不取样的情况下利用传感器技术判断和鉴别中药材真伪、质量好坏的方法[7]。近年来，电子鼻、电子舌等诸多仿生技术逐渐应用于中药鉴别领域。

电子舌技术[8]是一种模拟人类的舌头及其神经系统信息处理的智能味觉仿生系统，具有客观、快速、简便等优点。电子舌在中药鉴别的领域，主要用于鉴别药材的气味、种类、储存时间等，评价中药的五味、掩味效果、以及临床试验中气味剂的味道等方面。

电子鼻作为一种潜力十足的鉴别工具已广泛应用于农业、食品、医药、环境监控和公共安全等领域。田卉玄等以易霉变的肉豆蔻为研究对象，利用电子鼻检测不同霉变程度样品气味，同时通过HS-GC-MS对样品粉末进行挥发性成分测定，建立电子鼻与样品气味物质基础的关联性，结合主成分分析确定不同霉变程度的肉豆蔻在挥发性成分上存在差异。为快速区分不同霉变程度肉豆蔻的气味变化及其物质基础提供依据，也为电子鼻在中药鉴别领域的应用和研究提供一定的理论与实际参考[9]。

虽然仿生技术通过仿生设备表达出中药气味的响应值，在一定程度上弥补了人类仅凭靠感官鉴别中药的不足，但是仿生技术无法直接体现出中药材的气味和其化学成分的关联性，不能够以定量或者定性的方式制定中药材质量的鉴别标准，难以保障中药材的用药安全和实际疗效，再加上仿生技术的应用造价成本昂贵，所以仿生技术在中药鉴别领域的应用有待挖掘[7]。

1.3 微性状鉴别

中药微性状鉴别是借助体视显微镜、生物显微镜等仪器观察中药材表面等肉眼不易察觉的细微性状特征，并以此作为依据的一种鉴别方法[10]。微性状鉴别是传统的性状鉴别法向微观领域的延伸与拓展。微性状鉴定法与显微鉴定法的不同之处在于光线。显微鉴定法的光线是穿透药材，进行检材后形成的直射影像，能够清楚地反映细胞组织内部结构和形态，但也会呈现出组织不同层面影像的重叠，给具体判断药材带来一定的障碍。而微性状鉴定的光线不会穿透检材，只是光线投射到药材表面后经过反射形成的影像，能够清楚地展现药材表面的纹理、形状、色泽和起伏。运用微性状鉴别法能够快速且清晰地展现药材表面及断面的微性状特征，对于形态相似易混淆的药材，也能够弥补传统鉴别方法的不足，明显提高药材鉴别的准确性。因此，微性状鉴别法从经济方面、操作方面、鉴别结果方面、普适性等方面，都具有其他鉴别方法所难以具有的综合优势[11]。

刘屹[11]针对掺杂中药材和霉变药材，运用微性状鉴别法，在仪器下观察到霉变药材表面残留的少许菌丝体和芽孢，并且对药材组织中的内部结构都有了一定的掌握。袁仕君等[12]将36种矿物类中药粉末按颜色不同大致分为4类，利用体视显微镜的立体图像处理方法，分别对这4类矿物中药粉末进行微性状观察，得到了一系列鉴别结果，并比较和总结其鉴别特征，表明多数矿物类中药粉末可以通过体视显微镜观察到较明显的微性状特征，能够用于中药材的鉴别。梁珊珊等[13]根据中药微性状鉴定法，利用手机显微镜分别对五谷虫的不同部位进行图像采集和整理，对五谷虫的微性状特征进行研究分析，表明中药微性状鉴别法能够鉴别中药五谷虫，且具有准确度高，操作简便，效率高的优点。

2 显微鉴别

显微鉴别是利用显微镜来观察分析中药内部的细胞性状、组织构造以及细胞内含物特征，鉴定中药的真伪或制定显微鉴别的依据。由于中药的内部构造较稳定，多具有种的特异性，易于正确鉴别。该法适用于外形相似不易于区别的多来源中药、破碎和呈粉末状的中药，以及用粉末制成的丸、散、片、胶囊等中成药。显微鉴别通过光电子系统对人眼难以观察的微小细节进行观测，对不同中药加以区分，在不断实践中将显微鉴别分为2类：组织结构与粉末鉴定、半显微性状鉴别[14]。《中华人民共和国药典》收载的5种海马粉末通过显微鉴别，能够观察到特有的显微特征，例如横纹肌显微、皮肤碎片和骨碎片特征等。对羚羊角、穿山甲、珍珠、地龙、海马等珍稀药物粉末进行显微特征研究能够明确附注显微特征图[15]。扫描电镜具有较高的分辨率，放大倍数变化范围大，能使物质的图像呈现显著的表面立体结构(三维空间)的特征，观察的样品制备操作又较简易，所以在药材鉴定，特别是同科属种间的表面结构的鉴别比较上，已成为一种新的手段。卢广英等[16]简要介绍了扫描电镜在植物类、动物类及矿物类中药真伪鉴别中的应用，并表明扫描电镜可快速、有效地鉴别出仅通过普通光学显微镜等传统方法而难以辨别真伪优劣的中药，为市场出现的较为混乱的中药材及饮片来源提供了更简便、精确、可靠的鉴别技术手段。

3 理化鉴别

理化鉴别是利用物理的或化学的分析方法，对中药及其制品中所含有效成分或指标性成分进行定性和定量分析，以鉴别中药的真伪和品质优劣的一种方法与手段。

3.1 一般理化鉴别

一般理化鉴别主要包括呈色反应、沉淀反应、显微化学反应、微量升华、荧光分析、物理常数测定等。

3.1.1 呈色反应

利用中药所含化学成分能与某些试剂产生特殊颜色反应的性质鉴别中药。一般在试管中进行，也可直接在中药切片或粉末上滴加各种试剂观察呈现的颜色，用以判断中药中是否有某类或某种化学成分。

3.1.2 沉淀反应

利用中药的化学成分能与某些试剂产生某种性状的沉淀反应来鉴别中药。如黄芩的乙醇提取液，加醋酸铅试液生成橘黄色沉淀，表示黄芩含有黄酮或黄酮苷类成分。

3.1.3 显微化学反应

利用植物细胞后含物可与某些化学试剂发生反应的性质，将中药的少量粉末、切片或浸出液置于载玻片上，滴加某种化学试液后，通过显微镜观察产生的颜色变化、沉淀或结晶的生成、气体逸出等化学反应现象鉴别中药。如黄连粉末滴加稀盐酸，镜检可见簇状盐酸小檗碱结晶;若滴加30%硝酸，可见针状小檗碱硝酸盐结晶析出。

3.2 色谱法

现代色谱分析技术具有分离、分析双重功能，特别适用于含有复杂化学成分中药的定性、定量鉴别，在制定中药及其制品的质量标准、评价中药的有效性和安全性中得到越来越广泛的重视和应用。薄层色谱法是中药鉴别中最为常用的定性鉴别方法，高效液相色谱法和气相色谱法是常用的定性定量分析方法。

3.2.1 薄层色谱法

将中药或中药制品用适当溶剂提取并处理后制成供试品溶液与标准化学对照品溶液或标准对照药材溶液点于同一薄层板上。在层析缸内用展开剂展开，使供试品中的化学成分层析分离。用显色剂显色或紫外灯照射(254 nm 或 365 nm)下检视，或在薄层硅胶中加入荧光物质，采用荧光猝灭法检视。通过比较供试品溶液与对照物的色谱图进行鉴别。刘世欣等[17]采用TLC法对肾康宁胶囊进行定性鉴别研究，在原标准基础上增加了泽泻、丹参、茯苓和锁阳的专属性TLC鉴别方法，并进行了系统的方法学研究，提高临床应用的安全性和有效性提供技术支撑。

3.2.2 气相色谱法

采用气体为流动相(载气)，样品注入进样器加热气化，被载气带入色谱柱内各成分得到分离，先后进入检测器，用记录仪或数据处理器记录色谱图，进行中药化学成分的定性、定量分析。氮、氦、氢气可用作载气;色谱柱为填充柱或毛细管柱;气相色谱法最常用的检测器有热导检测器和火焰离子化检测器。气相色谱法最适用于含有挥发性及其它挥发性成分，或制成可气化的衍生物的非挥发性成分的中药的定性、定量分析。如丁香按照其相色谱法测定，以聚乙二醇20000(PEG-20M)为固定相，含丁香酚(C10H12O2)不得少于11.0%。高温下不能气化的成分不能进行分析。

3.2.3 高效液相色谱法

系采用高压输液泵将流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对样品进行分离测定的色谱分析方法。根据中药所含化学成分的性质，选用不同的色谱柱及适宜的流动相。高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、灵敏度和准确度高、重现性好，适用各类化学成分的分析等特点和优势，是中药化学成分定性定量、分析的首选方法。李雨昕等[18]参考相关文献和2020年版《中国药典》(一部)，建立了生三七及其炮制品的HPLC指纹图谱。通过HPLC指纹图谱及相似度评价发现，15批生三相似度为0.911～1.000，共16个共有峰;15批炮制品相似度为0.862～1.000，共25个共有峰。经对比，生三七与炮制品中共有12个共有峰相同;经与对照品对比，共指认了其中3个共有峰，分别为三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1。

3.3 分光光度法

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长或一定波长范围内的光吸收度而进行定性和定量分析的方法。常用的方法有下列几种：

3.3.1 紫外-可见分光光度法

根据有机化合物对200～760 nm 波长范围电磁波的吸收特性而建立的光谱分析方法，可用于化学结构中具有发色团或助色团的化学成分的定性、定量分析。特别是有色物质和具有共轭双键结构的无色物质的分析。对本身吸收弱或无吸收的化学成分，也可通过与某些化学试剂反应显色后进行测定。此法适用于测定中药中某类成分的总含量，如《中国药典》(2010年版)记载的是山楂叶中总黄酮，川贝母中总生物碱、知母中总皂苷的含量测定等。常用的仪器为紫外-可见分光光度仪或比色剂。含量测定方法主要有对照品比较法，吸收系数法和标准曲线法等，具有灵敏，简便，准确等特点。谷伟玲等[19]将紫外光谱在中药鉴别的应用方法分为四种：紫外光谱单一法、导数光谱法、紫外光谱组法、紫外光谱联合其它方法。

3.3.2 红外分光光度法

主要用于中药单体化学成分的定性鉴别。红外光谱鉴别需要标准品或标准图谱进行对照。近年，通过识别中药粗提物的特征吸收峰，直接用于中药粗提物的品种鉴别的报道越来越多，如珍珠、蟾蜍、麝香、熊胆等动物类中药的鉴别。李雨昕等采用OMNIC8.2.0软件建立生三七及其炮制品的红外(IR)指纹图谱并进行相似度评价，采用双指标序列分析法对15批生三七及其炮制品的IR指纹图谱吸收峰进行分析，并表明IR指纹图谱的相似度较好，能有效区分生三七及其炮制品。

3.3.3 原子吸收分光光度法

利用原子吸收分光光度计，测定中药中呈原子状态的无机元素的吸收光谱进行鉴别的方法。本法的专属性强，检测灵敏度高，测定速度快，是测定中药和中药制剂中微量元素、重金属的最常用方法。

3.4 中药理化鉴别新技术

3.4.1 气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)

将气相色谱仪与质谱检测器串联使用，发挥气相色谱对混合物中化学成分的分离优势和质谱的直接定性分析功能，可直接对中药中含有的挥发油类成分，或非挥发性成分经衍生化转为具有挥发性的物质进行分离和定性、定量分析。气相色谱使用的色谱柱常用毛细管色谱柱，质谱检测器常用电子轰击质谱仪(EIMS)。

3.4.2 高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)

将高效液相色谱仪与质谱检测器串联使用，发挥高效液相色谱化学成分的分离优势和质谱的直接定性分析功能，直接对中药含有的各类化学成分进行分离和定性、定量分析。高效液相色谱使用的色谱柱常用十八烷基键合相硅胶色谱柱，质谱检测器常用电喷雾离子化质谱仪(ESIMS)。此技术在中药的化学成分研究中已经得到广泛重视和应用。王郡瑶等[20]建立数据库来辅助中药成分鉴定，可以充分挖掘液质数据信息，并提高定性鉴别的效率。Luo等[21]开发了超高效液相色谱联用飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF MS)和快速分离液相色谱-三重四极杆线性离子阱质谱(RRLC-QTRAP MSn)方法，用于分别对小须明汤活性成分进行定性和定量分析。数据显示，使用UPLC-Q-TOF/MS在AF-XXMD中鉴定出48种化合物，包括14种生物碱、14种黄酮、12种三萜、3种色酮、3种单萜、1种氰苷、1种挥发油。与此同时，分别测定了各组分的含量，并表明氰基糖苷、单萜和类黄酮是小须明汤活性成分中含量最高的三种成分。

3.4.3 中药化学成分指纹图谱技术

中药的药效是所含多种化学成分通过多靶点、多环节发挥综合性作用的结果，特别是很多中药的化学成分十分复杂，且有效成分尚未明确，因此仅仅通过对中药中的某一种或某几种化学成分进行分析，其质量缺乏其科学性。中药化学成分指纹图谱鉴定法就是为解决这一客观难题而创立的一种新的中药质量评价方法。中药化学成分指纹图谱是指采用色谱或光谱分析方法建立的用于表征中药化学成分的特征图谱。在中药鉴定中，最常用的是高效液相色谱法、薄层色谱法或气相色谱法等色谱分析技术建立的指纹图谱。将中药经过适当处理后，应用现代色谱技术并结合化学计量学及计算方法，制定对中药所含化学成分的整体特征进行科学表征的专属性很强的图谱，用以评价中药的质量。指纹图谱全面反映了中药所含化学成分的整体特征，从而能更好地评价中药的内在品质。如银杏叶制剂的质量控制就是采用指纹图谱技术的成功范例。

三维荧光技术是20世纪80年代以荧光光谱分析为基础发展衍生出来的一种新分析技术。三维荧光图谱包含激发波长、发射波长和荧光强度3种信息，描述了荧光强度随激发波长和发射波长变化的关系，可以直观地表示荧光强度、荧光峰位置及荧光强度变化趋势，能提供比常规荧光图谱更为丰富的信息，更加完整地描述荧光物质的荧光特性。三维荧光图谱在速度快、成本低、专属性强、前处理简单等优点的基础上，能够更加全面地反映一个复杂物质的光谱信息，并且其具有较高的测量灵敏度，对分子的结构也具有较好的选择性，这些优点都使其应用范围变得越来越广[22]。乔淞汾[23]利用三维荧光技术结合化学计量学手段建立12种中成药的三维荧光指纹图谱，利用编写的Matlab程序获取相关特征参数，对其进行分析比较，为中成药的鉴别提供了数据参考。袁仕君等[24]在建立了生石膏和玄精石粉末的X-射线衍射(XRD)指纹图谱的基础上，采用相关系数进行相似度评价并确定了两者的鉴别阈值，对指纹峰的相对强度值进行了聚类分析和主成分分析，结果表明采用以上方法能够对生石膏与玄精石进行准确鉴别。

4 分子鉴别

4.1 DNA分子标记技术

DNA分子遗传标记鉴定是利用分子生物学的DNA分子遗传标记技术，通过测定生物间DNA分子遗传多样性来鉴定中药的基源，确定其学名的方法。DNA分子标记直接检测DNA分子上的差异，具有数量多、遍及整个基因组、多态性高、遗传稳定、不受环境及基因表达与否的限制，可对不同发育时期的生物个体、组织器官以及细胞进行检测的优点。

李慧等[25]根据红天麻、乌天麻重测序筛选SNP位点设计鉴别引物，并对PCR反应条件和反应程序中的关键因素进行了考察，确定了最优的PCR鉴别条件，建立红天麻、乌天麻及其杂交天麻特异性PCR鉴别方法。结果表明此方法具有效率高、成本低、稳定且特异性强等优点，为中药材品种鉴别提供了一种新的途径。杨灏等[26]收集平贝母及其他贝母材料，提取样品总基因组DNA，分析比对平贝母及其它贝母ITS片段，根据差异位点设计平贝母特异性引物，采用两步法进行PCR扩增，优化反应体系并对该方法进行耐受性和适用性考察。表明实验设计的平贝母特异性引物专属性强，所建立的特异性PCR方法可以用于平贝母的准确鉴别。

田娜等[27]基于STR分型原理建立了一种简单快捷的可用于胆粉类药材及其掺杂样品的通用DNA指纹图谱鉴别方法，并收集原动物或胆粉样本，使用筛选获得的鉴别引物12S-L1091/12S-H1478和16S-L3428/16S-H3667扩增并进行STR分型获得DNA指纹图谱。结果显示各物种的STR指纹图谱不同，可用于物种鉴别，并且DNA指纹图谱上能同时反映正品和伪品的信息，可鉴别中药的真伪品和掺杂品。

4.2 DNA条形码技术

DNA条形码的概念由加拿大动物学家Paul Heber首次提出，是指使用一段较短的、标准的、易扩增的DNA片段对物种进行快速、准确、标准化的鉴定。DNA条形码技术是以DNA序列为检测对象，建立DNA条形码数据库，可以机械重复且能够实现一次性快速并准确鉴别物种样本[28]。

李珍珍等[29]应用5条常用DNA条形码序列ITS、ITS2、psb A-trn H、mat K与rbc L对甘草属进行PCR扩增与序列测序，结合在Gen Bank数据库下载的序列数据，通过分析各序列种内与种间变异与遗传距离，构建系统发育树，并基于相似性搜索算法和最近距离法计算各序列鉴定成功率，以分析比较各序列对甘草属的鉴定效率。孙思雅等[30]提取棘海马和其他海马样品的基因组总DNA，对COⅠ和ATP6基因序列进行PCR扩增和双向测序，通过Blast对序列的准确性进行检验，利用MEGA 7计算序列的GC量，种内种间距离以及采用邻接法构建NJ系统发育树。通过性状鉴别和DNA条形码序列联用的方法确定了棘海马的典型性状和分子鉴别特征，为棘海马的准确鉴定和续应用提供了技术保证，并为扩大海马药用资源和保证海马药材临床用药安全提供了新的依据。辛天怡等[31]共收集212份市售中药饮片，包含根及根茎、果实种子、全草、花、叶、皮、茎木等不同入药部位，验证中药材DNA条形码分子鉴定法对中药饮片基原物种鉴定的适用性和准确性。研究证实中药材DNA条形码分子鉴定法能有效检出市售中药饮片的掺伪、混伪现象，可用于市售中药饮片的基原物种鉴定，值得在中药饮片加工生产企业及药品监督检验管理机构推广。姜波[32]按照第207条ITS2序列构建菟丝子的DNA条形码数据库，结合克隆程序，对从市场、医院、药店购买的菟丝子药材进行鉴别。结果发现70%市面销售的菟丝子药材存在混伪情况，并说明采用DNA条形码鉴定种子果实类药材和市场监督均有较好作用。Wei Shugen等[33]建立了基于DNA条形码的LC-MS/MS物种鉴定和定量分析综合评价体系。基于ITS2条形码区域的DNA条形码显示出足够的辨别力，可以精确识别来自七种钩藤属植物的24个样本。

4.3 RNA分子技术

Zhang Wen等[34]将高通量测序和生物信息学方法用于鉴定冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)中的保守和新型微小RNA样RNA(microRNA-like RNA)。鉴定了40个保守的微小RNA样RNA，同时预测了23个编码31个新微小RNA样RNA的pre-miRNA候选物。为进一步研究微小RNA样RNA作为冬虫夏草的活性成分在保健食品或中药中的潜在作用提供了有用的资源。

5 讨论

综上所述，性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别和分子鉴别在中药鉴别领域都有所进步与发展，均取得了一定的成果。纵观现有的鉴别技术，鉴定手段和方法随着化学、生物学、计算机学等学科的发展不断更新提升呈现出主观经验鉴别到客观数据判断的发展历程，分子鉴别已逐渐成为鉴别技术发展趋势之一。现代新鉴别技术客观准确，我们有望更多的鉴别新技术运用于中药材鉴别中，保证中药材的临床应用安全性。