HBV相关性肝癌患者血清中lncBRM的表达及临床诊断价值

臧倩 楼衷晗 包剑锋

肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发病率居全世界常见恶性肿瘤的第6位，全球每年约有74.5万人死于HCC，HCC已成为第2大致死性肿瘤[1-3]。HCC是一种独特的多因素疾病，HBV是其重要的危险因素[4]。我国是乙肝大国，70%～90%HCC患者的发病与HBV感染相关[5]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作为重要的调控因子参与了肿瘤发生、发展、转移等多种细胞生物学进程[6-7]，目前已有临床研究将lncRNA应用于部分肿瘤的早期诊断[8]。BRM是一种碱基对不超过200 nt的lncRNA。研究发现BRM相关长链非编码RNA（long non-coding RNA for association with BRM，lncBRM）在肝癌干细胞（cancer stem cells，CSCs）中高表达[9]。lncBRM是CSCs自我更新、维持肿瘤发展所必需的，lncBRM表达水平与肝癌患者的肿瘤恶性程度呈正相关。然而目前关于lncBRM的研究多局限于分子水平，对BRM在HBV相关性肝癌的诊断价值尚未明确。因此，本研究旨在探讨HBV相关性肝癌患者血清中lncRNA的表达及临床诊断价值。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2019年2月至2020年1月杭州市西溪医院收治的HBV相关性肝癌患者57例作为研究对象（肝癌组），其中男48例，女9例；年龄21～80（54.81±11.57）岁。HBV相关性肝癌纳入标准：（1）根据《原发性肝癌诊疗规范（2019年版）》[10]诊断为HBV相关性肝癌；（2）肝内占位病灶或肝外转移灶活检、外科手术切除组织标本，经病理组织学和（或）细胞学检查诊断为HCC；（3）未进行手术、射频消融、介入治疗（无水乙醇注射、肝动脉化疗栓塞术等）、靶向治疗、放疗、化疗及免疫治疗等其他治疗的初诊患者。排除标准：（1）之前于外院已进行手术、射频消融、介入治疗（无水乙醇注射、肝动脉化疗栓塞术等）、放疗、化疗及免疫治疗等其他治疗者；（2）严重心、肝、肾功能损害者；（3）患有精神疾病者；（4）患有除肝癌以外的其他恶性肿瘤者；（5）血清中丙型肝炎病毒阳性者：（6）血清中HBV阴性者。另选取在杭州市西溪医院体检的年龄相仿的健康体检者20例作为健康对照组，其中男 16例，女 4例；年龄 22～81（41.70±10.03）岁。健康对照组纳入标准：经实验室检验、超声检查、CT检查等辅助检查排除恶性肿瘤、慢性内科疾病、传染病等疾病史的健康人。两组受试者性别和年龄比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经杭州市西溪医院医学伦理委员会审批通过，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 血清中lncBRM表达水平检测 采用qRT-PCR法。分别收集57例HBV相关性肝癌患者和20例健康体检者静脉血5 ml（肝癌患者选择术前1周内血清），3 000 r/min离心10 min，吸取血清至1.5 ml无酶离心管中，-80℃保存。应用血清RNA快速提取试剂盒从血清样本中提取总RNA，分光光度计（Nano）检测RNA纯度及浓度。逆转录提取RNA，以RNAS18基因为内参，根据试剂盒的说明书进行qRT-PCR反应，计算血清中lncBRM的表达量。lncBRM、内参RNA S18的引物均由杭州艾迪康医学检验中心实验室合成并进行实验，RNA快速提取试剂盒（批号：DP503）购自天根生物科技有限公司，反转录试剂盒（批号：FSQ-201）购自东洋纺生物科技有限公司，qRT-PCR两步法试剂盒（批号：QPK-201）购自东洋纺生物科技有限公司。lncBRM上游引物：5'-GAGGAGAGAAGTCACTGAAATGG-3'，下游引物：5'-CTCTTCAAAGCAGACCCTCTAC-3'；RNA S18上游引物：5'-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3'，下游引物：5'-TAGTA-GCGACGGGCGGTGTG-3'。。

1.3 观察指标 统计HBV相关性肝癌患者性别、年龄、TNM 分期、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平、有无肝外转移、有无癌栓形成、有无血管侵犯、肿瘤直径大小、肿瘤数目等临床病理特征，并分析HBV相关性肝癌患者血清中lncBRM中表达水平与临床病理特征的关系。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。lncBRM表达量以 M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验；计数资料组间比较采用χ2检验。采用ROC曲线评估血清中lncBRM表达水平诊断HBV相关性肝癌患者的效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者血清中lncBRM表达水平比较 肝癌组患者血清中 lncBRM 表达水平为[1.03（0.44，2.07）]×10-4，明显高于健康对照组的[0.02（0.00，0.06）]×10-4，差异有统计学意义（Z=6.394，P＜0.01）。

2.2 HBV相关肝癌患者血清中lncBRM表达水平与临床病理特征的关系 TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有癌栓形成、有血管侵犯、肿瘤直径＞5 cm的HBV相关性肝癌患者血清中lncBRM表达水平分别高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ、无癌栓形成、无血管侵犯、肿瘤直径≤5 cm的患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而血清中lncBRM表达水平与患者性别、年龄、AFP水平、有无肝外转移、肿瘤数目均无关（均P＞0.05），见表1。

表1 HBV相关性肝癌患者血清中lncBRM表达水平与临床病理特征的关系（×10-4）

2.3 血清中lncBRM表达水平诊断HBV相关性肝癌患者的效能 ROC曲线显示血清中lncBRM表达水平诊断HBV相关性肝癌的AUC 为 0.983（95%CI：0.951～1.000，P＜0.01），Youden指数最大为0.932，最优截断值为0.203×10-4，灵敏度为0.982，特异度为0.950。结果提示血清lncBRM表达水平对HBV相关性原发性肝癌具有较高的诊断价值，见图1。

图1 血清中lncBRM表达水平诊断HBV相关性肝癌的ROC曲线

3 讨论

HBV相关性肝癌作为世界上最常见的恶性肿瘤之一[11]，其发病率呈稳步上升趋势。多数HBV相关性肝癌早期缺乏特征性的临床表现，确诊时已为中晚期，从而导致治疗效果不佳、预后极差[12]。血清AFP检测是当前HBV相关性肝癌早期筛查最常用的检查方法，但此方法不易发现早期微小癌灶，灵敏度不高易漏诊[13]，无法满足肝癌诊断尤其是早期诊断的临床需要；超声、CT等检查对肝癌诊断具有重要的临床价值，但是对于微小癌灶的诊断仍旧不足[14]。尽管超声造影、增强CT、MRI对于微小癌灶的诊断具有一定优势[15]，但目前不是临床肝癌初筛的常规手段。近年来，lncRNA已被证实在许多生物过程中发挥重要作用[16]。因此，寻找早期诊断肝癌的lncRNA具有重要的临床意义。

在肿瘤发生、转移等细胞生物学进程中，lncRNA都是重要的表观遗传学调控因子[17]。Wang等[18]研究发现血清lncRNA-p21可作为HBV相关性肝癌患者肝细胞损伤的潜在生物标志物。一项纳入820例HCC患者和785例健康者的Meta分析结果表明，血清lncRNA在肝癌诊断上具有较高的临床价值。因此lncRNA可用于辅助诊断肝癌[19]。

CSCs是分化较差的癌细胞，具有与正常干细胞相似的特征，能够生长、侵袭和再生，负责癌症术后的复发和转移[20-21]。而lncBRM能够促进肝癌瘤体成型及CSCs增殖[22]。Zhu等[20]发现lncBRM敲除后成瘤能力最弱，结合本研究结果显示肝癌组患者血清lncBRM表达水平明显高于健康对照组，提示lncBRM可能参与了肝癌的发生、发展。另外，根据ROC曲线分析结果，血清中lncBRM表达水平对肝癌诊断具有一定的潜在价值。

综上所述，本研究表明血清lncBRM对HBV相关性肝癌具有较好的临床诊断价值，后续将进一步研究lncBRM是否能为肝癌术后的复发转移提供新的治疗靶点，能否作为HBV相关性肝癌患者预后判断的客观指标。